Ce protocole peut être utilisé pour construire des modèles 3D de distribution des métabolites et des parasites. Cela peut aider à comprendre la relation entre la perturbation métabolique des tissus locaux, la distribution des parasites et les symptômes cliniques de la maladie. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet une cartographie inter-organes à l’échelle réelle de la distribution des métabolites par rapport à la distribution des agents pathogènes et son analyse statistique.
Théoriquement, la cartographie chimique peut explorer le développement et l’impact de la maladie sur l’hôte en examinant directement les métabolites responsables de la pathogenèse et les effets du traitement. Commencez par peser et étiqueter les tubes. Coupez systématiquement les tissus avec une section par tube.
Peser les tubes contenant des échantillons de tissus pour déterminer le poids de l’échantillon et enregistrer le poids. Pour effectuer l’homogénéisation à base d’eau des échantillons de tissus, ajoutez une bille d’acier inoxydable de cinq millimètres aux deux tubes de microcentrifugation millilitres contenant des échantillons de tissus. Faites un tube vierge contenant de l’eau de qualité LCMS.
Augmenter le volume à 500 microlitres par 50 milligrammes d’échantillon en ajoutant de l’eau réfrigérée de qualité LCMS, puis homogénéiser les échantillons à 25 hertz pendant trois minutes. Les échantillons doivent être soigneusement homogénéisés. Collecter 1/10ème du volume d’homogénéisation pour l’extraction de l’ADN et d’autres analyses.
Ajouter au méthanol glacé de qualité LCMS enrichi de quatre micromolaires de sulfachloropyridazine à l’homogénat. Homogénéiser les échantillons dans un homogénéisateur tissulaire à 25 hertz pendant trois minutes, suivi d’une centrifugation pendant 10 minutes. Recueillir un volume égal de surnageant dans une plaque de 96 puits et garder les résidus solides sur la glace tout en recueillant les surnageants.
Sécher complètement le surnageant d’extraction aqueux en utilisant une vitesse maximale et sans chauffage. Effectuer une extraction organique en ajoutant 1 000 microlitres de méthanol dichlorométhane prérefroidisé enrichi de deux sulfachloropyridazine micromolaires par 50 milligrammes d’échantillon de résidus solides. Homogénéiser les échantillons à 25 hertz pendant cinq minutes, suivis d’une centrifugation pendant 10 minutes.
Collectez un volume égal de surnageant dans une plaque de 96 puits. Prenez une photo de l’organe d’intérêt. Cliquez sur Fichier, puis sur Importer dans le logiciel SketchUp pour importer une image des organes d’intérêt.
Cliquez sur l’outil Lignes et sélectionnez l’option à main levée. Utilisez l’outil crayon pour tracer et dessiner les contours des organes d’intérêt. Sélectionnez l’outil push/pull et tirez vers le haut sur la zone ombrée pour convertir le dessin de 2D en 3D.
Exportez le fichier au format dae en cliquant sur Exporter le fichier, puis sur modèle 3D. Pour améliorer le réalisme du modèle, importez le modèle dans le logiciel MeshLab en sélectionnant Fichier, puis en cliquant sur Importer le maillage. Sélectionnez Wireframe dans le menu supérieur, puis sélectionnez Filtres, cliquez sur Remeshing Simplification and Reconstruction, puis sur Subdivision Surfaces Midpoint.
Laissez toutes les valeurs par défaut et sélectionnez Appliquer deux fois. Exportez le modèle au format sdl en cliquant sur Fichier, puis sur Exporter le maillage sous, puis en sélectionnant Format de fichier SDL dans le menu déroulant Type de fichiers. Enregistrez-le et sélectionnez OK dans le menu contextuel suivant.
Ouvrez le logiciel Meshmixer et importez le fichier sdl généré à l’étape précédente. Utilisez la sculpture, les pinceaux, la sculpture du dragon, les pinceaux, les outils de gonflage pour extraire les surfaces du modèle qui doivent être arrondies. Enregistrez-le au format sdl une fois que le modèle a l’apparence souhaitée en cliquant sur Fichier et exporter.
Nommez le fichier comme vous le souhaitez, sélectionnez le format binaire SDL et enregistrez-le. Ouvrez le modèle 3D dans le logiciel MeshLab. Cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle de traitement post-ouverture.
Obtenez les coordonnées X, Y et Z pour chaque point d’échantillonnage en sélectionnant l’outil Points de prélèvement, puis cliquez avec le bouton droit de la souris à intervalles réguliers sur la surface du modèle 3D. Une fois que toutes les coordonnées souhaitées ont été sélectionnées, cliquez sur le bouton Enregistrer le plus haut dans la fenêtre contextuelle du formulaire. Dans un tableur, ouvrez le fichier pp généré à l’étape précédente.
Ajustez l’affichage des données en cliquant sur Texte des données en colonnes, puis sur Délimité. Cliquez sur Suivant, puis sélectionnez Espace et cliquez sur Terminer. Reformatez de sorte que seules les valeurs numériques restent dans les cellules de la feuille de calcul en sélectionnant Rechercher dans l’accueil et Sélectionner Remplacer.
Dans la zone Trouver quoi, entrez Y égale et laissez la case de remplacement vide. Cliquez sur Remplacer tout, puis sur OK. Répétez l’opération pour X couche égale et pour Z couche égale et pour la barre oblique supérieure à. Dans le tableau du table du tableur, les lignes correspondent à chaque position et les colonnes aux données.
Collez les métadonnées appropriées et l’abondance des caractéristiques métabolites dans les colonnes de feuille de calcul suivantes. Dans la colonne rayon, entrez la taille souhaitée des points d’échantillonnage à visualiser sur le modèle. Déterminez empiriquement les valeurs du rayon et enregistrez le fichier au format CSV.
Accédez au logiciel ELI Plot, sélectionnez Surface, puis faites glisser et déposez le modèle 3D créé dans la fenêtre du navigateur. Faites glisser et déposez la table des fonctionnalités créée dans la même fenêtre de navigateur. Utilisez la légende dans le coin inférieur droit pour projeter la colonne de données souhaitée sur le modèle 3D.
Sélectionnez consécutivement chaque colonne de données pour évaluer la distribution de cette caractéristique métabolite sur le modèle 3D. Cette analyse a conduit à un tableau de 5 502 entités et à leur visualisation en 3D. Cette approche permet de visualiser les caractéristiques des métabolites chez les animaux individuels qui sont élevés sur le site d’une charge parasitaire élevée, les métabolites à distribution différentielle entre les régions tissulaires et les caractéristiques des métabolites qui se trouvent à des niveaux comparables dans le petit et le gros intestin.
Il est important de ne pas oublier de n’utiliser que des solvants LCMS et de prélever tous les tissus adjacents et d’extraire les métabolites pour tous les échantillons prélevés afin d’éviter les lacunes dans les cartes spatiales. Cette technique peut être utilisée pour explorer les besoins en nutriments pour la colonisation tissulaire par les parasites trypanosomatidés afin de comprendre la pathogenèse de la maladie en comparant les cartes de distribution des métabolites 3D lors de l’infection.
