Ce protocole génère des données de transcription à haut débit des cellules individuelles des îlots humains, qui peuvent être utilisées pour étudier l’hétérogénéité des cellules anochromes, identifier le type de cellules rares et la régulation des gènes dans les maladies. Cette technique génère des données à plus grande échelle à cellules simples, est facile à utiliser et a un temps de traitement assez court. Cette méthode peut être appliquée aux îlots d’autres espèces et pour profiler d’autres tissus fraîchement isolés.
Cependant, le protocole doit être optimisé en fonction des procédures de dissociation spécifiques aux tissus. Il est essentiel de préparer des cellules dissociées de haute qualité. Qc de la suspension cellulaire avant le cloisonnement d’une seule cellule est la clé, tout comme la manipulation de l’émulsion avec soin et rapidité.
Certains points de contrôle de qualité comme savoir si une puce s’est obstruée sont mieux vus que lus. Après avoir obtenu des îlots humains et incubé pendant la nuit, comptez et piéciez 200 à 300 îlots à l’aide d’une pipette P200. Transférer les îlots dans un tube conique de 15 millimètres contenant cinq millimètres de supports complets d’îlots, préchauffés à 37 degrés Celsius.
Placer le tube dans une centrifugeuse à 200 fois G pendant deux minutes. Aspirez doucement le surnatant sans déranger la pastille sur le fond. Ajouter un millimètre de solution de dissociation cellulaire préchauffée et perturber la pastille en pipetant doucement de haut en bas.
Incuber les îlots à 37 degrés Celsius pendant neuf à 11 minutes. Toutes les trois minutes, pipette de haut en bas lentement pendant 10 secondes pour dissocier les cellules en cellules individuelles. Une fois que les cellules de l’îlot sont bien dissociées et que la solution devient trouble, ajoutez neuf millilitres de supports complets d’îlots et filtrez à travers une passoire cellulaire de 30 micromètres dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.
Recueillir les cellules par centrifugation à 400 fois G pendant cinq minutes. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en 200 à 300 microlitres de la solution 1X PBS 04%BSA. Maintenant, mélangez 10 microlitres de la culture cellulaire avec 0,5 microlitres d’AO/DAPI.
Pipette de haut en bas pour bien mélanger. Chargez 10,5 microlitres sur une glissière et exécutez l’analyse du nombre de cellules sur un compteur de cellules automatisé à base de fluorescence pour déterminer le nombre et la viabilité. Placer une puce microfluidique dans un étui à copeaux.
Orientez le étui à copeaux, en veillant à ce que les puits de pétrole soient les plus proches de la personne qui effectue l’expérience. Utilisez une pipette pour ajouter le volume calculé des cellules dans les bandes de tube préparées. Pipette à mélanger cinq fois.
Sans jeter les pointes pipette, transférer 90 microlitres de mélange cellulaire pour ramer l’une des puces. Attendez 30 secondes, puis pipette très lentement pour charger 40 microlitres de perles de gel à la rangée deux. Distribuez 270 microlitres d’huile de cloisonnement aux puits de la rangée trois.
Accrochez le joint de puce sur les onglets du support de la puce. Placez le support de puce assemblé dans le dispositif de partitionnement d’une seule cellule et appuyez sur le bouton d’exécutement. À l’achèvement de la course, retirez le joint de copeaux du support, ouvrez le étui à copeaux à un angle de 45 degrés et transférez 100 microlitres de l’émulsion de la puce dans un puits dans une plaque de puits en plastique bleu 65.
Distribuez 125 microlitres d’émulsion rose brisant le reagent dans chaque émulsion. Attendez une minute, puis transférez tout le volume de chaque puits dans chaque tube de 0,2 millilitre. Assurez-vous qu’il y a une couche de clair et une couche de rose dans la bande de tube.
À l’aide d’une pipette, retirer 125 microlitres de la couche rose du fond de la bande de tube sans perturber la couche claire. Il est normal qu’un petit volume d’environ 15 microlitres de la couche rose reste dans le tube. Ajouter ensuite 200 microlitres de mélange de nettoyage à chacune des bandes de tube et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
Transférer les bandes de tube sur un support magnétique et attendre deux minutes pour permettre à la solution de se dégager. Retirer le surnatant et jeter. Ensuite, lavez les perles avec 80% d’éthanol deux fois.
Laisser sécher les perles pendant une minute. Retirer les bandes de tube de l’aimant et ajouter 35,5 microlitres de solution d’élitution aux perles. Pipette pour re-suspendre les perles dans la solution et incuber pendant deux minutes à température ambiante.
Transférer les bandes de tube sur un support magnétique et permettre à la solution de se dégager. Transférer l’ADN complémentaire purifié des bandes de tube pour nettoyer les bandes de tube de 0,2 millilitre. Pour amplifier l’ADN complémentaire, ajoutez d’abord 65 microlitres de mélange principal complémentaire d’amplification de l’ADN à chaque échantillon.
Placez les bandes de tube dans un thermocycleur et exécutez le programme selon le manuscrit. Les échantillons peuvent être conservés à quatre degrés Celsius jusqu’à 72 heures. Après avoir normalisé l’ADN complémentaire à 15 anagrammes et 20 microlitres, aliquot 30 microlitres de mélange de tagmentation à chaque échantillon d’ADN complémentaire sur la glace.
Mettez les échantillons dans le thermocycleur et exécutez le protocole de tagmentation à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes, diminuant à 10 degrés Celsius et maintenez. Ajoutez ensuite 60 microlitres de l’indice d’échantillon PCR Master Mix et 10 microlitres de l’indice d’échantillon forolegol de 20 micromolaires à l’échantillon d’ADN complémentaire purifié de 30 microlitres. Retournez les tubes au thermocycleur pour amplifier le produit final de la bibliothèque.
Normalisez chaque échantillon avec de l’eau à deux nanogrammes par microlitre et tirez trois microlitres de chaque échantillon normalisé ensemble dans un tube de 1,5 millilitre. Diluer le pool avec tampon d’élitution à 0,25 nanogramme par microlitre. Déliaturez la piscine en combinant 12 microlitres de l’échantillon dilué de piscine, un microlitre d’un animal ou d’un contrôle d’ADN, deux microlitres de tampon d’élitution, et cinq microlitres de 0,4 hydroxyde normal de sodium.
Incuber le mélange pendant cinq minutes, puis ajouter 10 microlitres de Tris de 200 milli molaires au pH8, et charger 4,05 microlitres du mélange en 1345,95 microlitres de HTA-1. Ensuite, chargez 1,3 millilitres dans la cartouche du séquenceur et exécutez selon les directives du fabricant à l’aide d’une recette de séquençage. Sur l’ordinateur, exécutez Cell Ranger pour dé-multiplexer les fichiers d’appels de base bruts générés par le séquençage dans les fichiers FASTQ.
Alignez les fichiers FASTQ sur l’assemblage du génome de l’homme b37.3 et utilisez le modèle génétique CSC pour obtenir la quantification de l’expression. Examinez l’intrigue de classement du code à barres pour être sûr de la séparation des codes à barres associés à la cellule et de l’arrière-plan. Pour contrôler la qualité des cellules, exclure les cellules ayant moins de 500 gènes détectés, moins de 3000 identificateurs moléculaires uniques et un score de viabilité supérieur à 0,2.
Ajuster les coupures en fonction des types de tissus et de cellules. Ensuite, utilisez R paquet mclust pour enlever les cellules qui expriment plus d’un gène hormonal. Utilisez le seurat de paquet R pour normaliser l’expression des gènes par les identificateurs moléculaires uniques totaux et multiplier par un facteur d’échelle de 10 000 au niveau cellulaire.
Détectez ensuite les gènes variables à l’aide de l’expression moyenne et de la dispersion de toutes les cellules. Ajuster les coupures en fonction des types de tissus et de cellules. Effectuez l’analyse des composants principaux avec les gènes variables.
Cellules à grappes avec un certain nombre de composants principaux. Dérivez des gènes enrichis en grappes cellulaires en comparant un groupe cellulaire avec le reste des cellules. Dans ce protocole de séquençage d’ARN de cellule simple, les îlots humains acquis ont d’abord été dissociés comme validés par les cellules alpha et bêta dans la fluorescence d’ARN et l’hybridation de C2.
Un exemple réussi d’émulsion suivant l’étape de partitionnement montre une solution pâle et trouble uniforme avec l’huile de partitionnement minimale séparée des perles de gel. En revanche, une émulsion de mauvaise qualité avec séparation de phase claire entre les perles de gel et l’huile pourrait être due à un sabot pendant la course de copeaux. Après amplification complémentaire de l’ADN, une distribution représentative de la taille d’un fragment montre le pic typique d’un échantillon d’ADN complémentaire de bonne qualité résidé près de 1000 à 2000 paires de base.
Le pic près de 600 paires de base était spécifique à l’ADN islet-complémentaire. La distribution de la taille d’un fragment pour les bibliothèques de séquençage de l’ARN se situe entre 300 et 500 paires de base. L’analyse de clustering a indiqué 12 types de cellules dans l’espace des dimensions stochastic voisines d’intégration T-distribuées.
Trois sous-populations dans les cellules alpha et quatre dans les cellules bêta ont été indiquées. Cette technique permet aux chercheurs de construire des îlots cellulaires complets pour les îlots humains. Avec plus de données provenant de donneurs non diabétiques et diabétiques, il est utilisé pour la découverte de cibles thérapeutiques.
