Ce protocole peut facilement générer des sphéroïdes de poisson zèbre, un modèle 3D in vitro avec différentes applications potentielles dans les tests de toxicité des poissons. Il s’agit d’une méthode simple et rapide pour générer des sphéroïdes uniques de lignées cellulaires de poisson zèbre très similaires en taille et en forme. Si vous suivez correctement toutes les étapes décrites, vous ne devriez rencontrer aucun problème.
Les sphéroïdes du poisson zèbre peuvent grandement bénéficier au mécanisme, l’exploration des effets chimiques sur les poissons, ce qui contribue à améliorer l’évaluation de la sécurité environnementale de produits tels que les cosmétiques. La démonstration de la procédure sera Irisdoris Rodrigues de Souza, un docteur en génétique de mon laboratoire. Pour commencer, prenez une fiole T75 de cellules de poisson zèbre à environ 80% de confluence.
Retirer le milieu complet et laver les cellules en ajoutant 0,01 molaire de PBS dans la fiole de culture à l’aide d’une pipette. Laver la fiole de culture avec du PBS en secouant doucement la fiole, puis retirer le PBS. Ajouter trois millilitres de trypsine 0,5 millimolaire EDTA dans le ballon de culture et incuber à 28 degrés Celsius pendant trois minutes.
Pour le détachement des cellules de la fiole, tapoter doucement la fiole pour libérer les cellules. Et puis arrêtez la digestion de la trypsine en ajoutant trois millilitres de milieu de culture complet dans le ballon. À l’aide d’une pipette, transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres et centrifuger à 100 g pendant cinq minutes.
Ensuite, retirez délicatement le surnageant. Ajouter un millilitre du milieu complet pour la lignée cellulaire respective utilisée et remettre en suspension la pastille à l’aide d’une micropipette. Ajouter 10 microlitres de la suspension cellulaire et 10 microlitres de colorant bleu trypan à un microtube pour compter les cellules et évaluer leur viabilité.
Mélanger la suspension cellulaire et le colorant à l’aide d’une pipette et transférer 10 microlitres de ce mélange dans une chambre Neubauer. Comptez les cellules dans les quatre grands carrés ou quadrants placés aux coins de la chambre, en considérant les cellules qui n’absorbent pas le bleu de trypan comme viables. Calculez ensuite le nombre de cellules viables à l’aide de l’équation affichée à l’écran.
Multipliez ce nombre de cellules par deux pour calculer le nombre final de cellules dans la suspension cellulaire. Après avoir calculé le nombre de cellules, ajuster la suspension de cellule à la plaque de 200 microlitres de cette suspension par puits d’une plaque ULA à fond rond de 96 puits avec le nombre de cellules requis pour chaque lignée cellulaire. Préparez la suspension avec la concentration ajustée de cellules dans un réservoir de milieu et mélangez-la à l’aide d’une micropipette multicanal sans former de mousse ou de bulles.
Ajouter 200 microlitres de la suspension cellulaire ajustée à chaque puits de la plaque ULA à fond rond. à l’aide d’une pipette multicanal. La plaque doit être scellée avec du parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour éviter l’évaporation du milieu de culture de la plaque de 96 puits.
Incuber la plaque sur un agitateur orbital à 70 tr / min pendant cinq jours dans un incubateur à 28 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Après cinq jours, observez les sphéroïdes sous un microscope à lumière inversée pour évaluer les sphéroïdes générés. Pour mesurer leur forme et leur taille, obtenir des images des sphéroïdes et utiliser un logiciel pour traiter et analyser les images.
Après avoir configuré le logiciel pour mesurer une zone sélectionnée en fonction d’une échelle connue, sélectionnez la face externe du sphéroïde pour déterminer sa surface et sa circularité. L’aire du sphéroïde est utilisée pour déterminer sa taille en calculant le diamètre, d, et le logiciel fournit la circularité du sphéroïde par une formule qui utilise l’aire et le périmètre sélectionnés. Un agrégat cellulaire ZFL est formé le premier jour de l’agitation orbitale.
L’agrégat cellulaire augmente sa circularité le troisième jour et atteint une forme sphéroïdale adéquate le cinquième jour. Un sphéroïde ZFL âgé de 16 jours dans une plaque ULA est montré ici. La lignée cellulaire ZEM2S forme des sphéroïdes dès le premier jour de l’agitation orbitale.
Le sphéroïde conserve sa forme et augmente de taille le troisième jour, et sa circularité maximale est atteinte le cinquième jour. Un sphéroïde ZEM2S âgé de 10 jours dans une plaque ULA est montré ici. La taille mesurée des sphéroïdes des lignées cellulaires ZFL et ZEM2S et l’indice de circularité mesuré des sphéroïdes ZFL et ZEM2S sont présentés dans cette figure.
Cette image graphique représente le modèle de croissance des sphéroïdes ZFL et ZEM2S. Un sphéroïde ZFL et un sphéroïde ZEM2S formés après cinq jours de secousses orbitales à 100 tr / min sont montrés ici. Le schéma de croissance et l’indice de circularité des sphéroïdes formés à des vitesses de rotation de 70 et 100 tr/min sont présentés dans cette figure.
70 tr / min est la vitesse la plus adéquate pour former des sphéroïdes ZFL et ZEM2S par cette méthode. La coloration des membranes cellulaires par Lectin Alexa Fluor 594 et des noyaux par DAPI démontre l’intégrité cellulaire au cœur des sphéroïdes. La fluorescence de la résoruurine formée par une réduction d’AlamarBlue démontre des cellules viables dans le noyau des deux sphéroïdes.
Le test de viabilité MTT en culture 3D et en culture 2D de la lignée cellulaire ZEM2S et ZFL est présenté ici, ne démontrant aucune différence significative. Lorsque vous essayez cette procédure, assurez-vous de sceller les plaques pour éviter de modifier le pH du milieu de culture et l’évaporation dans les puits. Les sphéroïdes peuvent être appliqués dans une variété de tests in vitro pour évaluer les effets toxiques dans le foie de poisson ou des études de développement utilisant la lignée cellulaire embryonnaire ZEM2S.
Ce protocole peut aider à faire avancer le développement d’essais in vitro sur les poissons, contribuant ainsi à l’avancement des études d’écotoxicité sans animaux.
