La septicémie peut entraîner une défaillance multi-organes et la mort. L’endotoxine est un composant fondamental des bactéries gramnégatives. Des niveaux élevés de circulation de l’endotoxine pourraient identifier le patient à risque plus élevé de développer une maladie plus grave.
L’analyse d’activité d’endotoxine peut être employée comme biomarqueur simple, rapide, et fiable de l’endotoxémie systémique. La détection précoce de cette toxine pourrait aider les cliniciens à traiter les patients présentant un choc septique. Dans le patient présentant le choc septique, l’identification tôt d’une condition en évolution rapide pourrait inciter une thérapie plus rapide et plus intensive de soutien de vie, menant potentiellement à de meilleurs résultats.
Lisa Mathiasen, biologiste moléculaire qui collabore avec notre groupe de recherche, démontrera cette procédure. Pour commencer cette procédure, définissez un kit de test EA et déballez les cinq types différents de tubes. Utilisez le tube numéro un, le tube de contrôle, pour mesurer l’activité basale de l’éclatement oxydatif non spécifique des neutrophiles du patient en l’absence d’un anticorps spécifique.
Utilisez le tube numéro deux, le tube Sample, pour mesurer l’éclatement oxydatif en réponse au complexe d’anticorps LPS. Utilisez le tube numéro trois, le tube Max, pour mesurer l’éclatement oxydatif maximal des neutrophiles du patient en réponse à un excès d’endotoxine. Utilisez le tube numéro quatre, le tube LPS, comme source d’endotoxine exogène.
Et utilisez le tube numéro cinq, le tube Aliquot, pour le stockage du sang. Prélevez des échantillons de sang des patients dans des tubes stériles contenant de l’anticoagulant EDTA et conservez-les à température ambiante avant d’exécuter le test d’évaluation environnementale. Avant de commencer le test, allumez le chimiomètre et le shaker de l’incubateur et réchauffez l’incubateur à 37 degrés Celsius.
Tout d’abord, placez les tubes EA à utiliser dans les supports à tubes, et retirez les bouchons. Utilisez une combipipette pour transférer un millilitre du réaccélésseur EA de la bouteille dans les tubes numéro un, numéro deux et numéro trois en descendant le côté des tubes. Inversez doucement le tube de collecte de sang 20 fois pour mélanger l’échantillon de sang du patient.
Ensuite, pipette 0,5 millilitres de sang patient dans le tube numéro quatre et tube numéro cinq. Vortex tube numéro quatre pendant 10 secondes. Placez les supports à tubes avec tous les tubes à essai EA dans le shaker de l’incubateur.
Fermez le couvercle et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, ouvrez le couvercle de l’incubateur et retirez les supports à tubes du shaker. Vortex tube numéro cinq.
À l’aide d’une pointe stérile, pipette 40 microlitres de sang dans les tubes numéro un et numéro deux, en double. Vortex tube numéro quatre. À l’aide de la même pointe de pipette, transférer 40 microlitres de sang du tube numéro quatre dans le tube numéro trois, en double.
Vortex les six derniers tubes à essai un par un. Remettre les supports à tubes dans le shaker en incubation et fermer le couvercle. Réglez le shaker à 100 rpm et démarrez le mouvement pendant 14 minutes.
Insérez la carte à puce étiquetée EA dans le chimiomètre et appuyez sur Démarrer. Après l’incubation de 14 minutes, suivez les instructions affichées sur le chimiomètre. Vortex doucement chaque tube pendant 10 secondes avant de le placer sur le porte-échantillon du chimiomètre.
Ouvrez le tiroir de l’échantillon et placez le tube numéro un dans le porte-échantillon. Ensuite, fermez le tiroir de l’échantillon et attendez la lecture relative de l’unité de lumière. Répétez ce processus de lecture pour les tubes deux et trois et tous les doublons, tels que décrits dans le protocole texte.
Une fois que tous les tubes ont été traités, les résultats de l’EE seront calculés et imprimés automatiquement. Répétez l’analyse complète de chaque échantillon de sang qui doit être testé. Conservez le kit EA Assay et ses composants dans l’emballage scellé d’origine à une température comprise entre deux et 25 degrés Celsius.
Dans cette étude, un essai d’activité d’endotoxine est exécuté pour détecter l’endotoxémie de sang entier dans les patients gravement malades. Une valeur d’EA de moins de 0,40 unité d’EA indique un faible niveau d’activité d’endotoxine, égal à une faible concentration de LPS circulant, qui représente un faible risque de progression vers un état de maladie grave. Un résultat entre 0,40 et 0,59 unités d’EA indique un niveau intermédiaire d’activité d’endotoxine, qui représente un risque intermédiaire pour le développement de la septicémie grave et du choc septique.
Des résultats égaux ou supérieurs à 0,60 unité d’ÉVALUATION environnementale indiquent un niveau élevé d’activité endotoxine, ce qui représente un risque élevé de choc septique et de mauvais résultats pour les patients. Le sang des tubes numéro quatre et cinq doit être mélangé avec le tube à essai correct. Un soin supplémentaire doit être pris pour suivre l’ordre correct indiqué dans le protocole.
Chaque tube est exécuté en double, ce qui peut entraîner des erreurs dans cette phase. Après son introduction, l’essai d’EA a été proposé comme biomarqueur pour la stratification de risque du patient présentant l’hypoperfusion systémique. En outre, il a été étudié comme test de dépistage pour sélectionner des patients pour des stratégies avancées de traitement de l’hémopurification.
