Cette méthode peut aider à répondre à la question de savoir comment l’intégration du provirus du VIH influence l’expression des gènes androgynes et pourquoi certains sites d’intégration génomique sont sélectionnés dans des cellules récemment infectées par le VIH. Le principal avantage de cette technique est que des modèles in vitro d’infection par le VIH peuvent être produits, qui transportent des reporters proviraux ciblés sur des sites d’intégration choisis à l’aide de l’ingénierie génomique basée sur CRISPR/Cas9. Thomas Walther, doctorant, et Julia Bialek, postdoc de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Commencez par utiliser ucsc Genome Browser pour extraire in-silico la séquence génomique du locus génomique désiré pour être ciblé. Pour choisir le guide ARN de 20 nucléotides pour cibler le locus génomique choisi, utilisez l’outil Web E-CRISP. Ensuite, sélectionnez, Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.
Génome de référence comme organisme et entrée 2000 paires de base de la séquence génomique, couvrant le locus génomique désiré précédemment extrait. Commencez une recherche d’ARN-guide à l’aide de paramètres d’application moyens avec n’importe quel PAM, toutes les cinq cibles de base et hors cible tolèrent les inadéquations et les introns exclus et les îles CPG. De la liste avec les conceptions possibles de guide-ARN qui apparaît, sélectionnez un ARN de guide avec un score élevé pour la spécificité et l’efficacité, qui est proche autant que possible du locus génomique désiré pour être visé.
Ouvrez le navigateur NCBI Blast pour faire sauter la séquence guide-ARN choisie par rapport au génome de référence. Pour vérifier l’unicité du site de liaison guide-ARN sélectionné, sélectionnez d’abord l’humain comme génome, puis entrez la séquence guide-ARN comme séquence de requête. Sélectionnez ensuite des séquences très similaires ou Mega Blast comme programme pour vous assurer que la séquence guide-ARN est unique.
Après cela, sélectionnez in-silico 1000 paires de base, en amont et en aval de la séquence guide-ARN de la séquence génomique extraite au début. Utilisez ces paires de base sélectionnées de 1 000, en amont et en aval, comme bras d’homologie à cinq et trois premiers pour cibler la construction vectorielle et la séquence de reporters à cibler. 24 heures avant la transfection des cellules T de jurkat, préparez une plaque complète de 6 puits des cellules pour une expérience de ciblage unique.
Pour commencer, plaque 1, 250.000 cellules dans 2,5 millilitres de RPMI 1640 avec des suppléments et sans antibiotiques, par puits. Le lendemain, ajouter aux microgrammes de vecteur de ciblage circulaire et deux microgrammes de Cas9 et plasmide d’expression guide-ARN par puits, à 250 microlitres de milieu commercial RPMI optimisé pour la transfection, dans un tube de réaction et bien mélanger par vortex. Ajouter ensuite lentement 12 microlitres d’agent transfection au milieu de l’ADN sans toucher la paroi du tube.
Feuilleter le tube et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter le mélange dropwise à un puits de cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Et 72 heures après la transfection, tirez sur les cellules transfectées, comptez-les et préparez-vous à l’enrichissement par FACS. Après avoir confirmé les événements de ciblage dans la population mixte de cellules ciblées, commencez à générer des clones à cellules individuelles en préparant à l’avance un milieu conditionné par jurkat, en recueillant l’IRP avec des antibiotiques provenant de cellules T de jurkat saines et non traitées. Centrifuger les tubes pendant 5 minutes à 300 G, et filtrer le supernatant avec une seringue de 25 millilitres, à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres.
Comptez les cellules ciblées précédemment enrichies par facs, 10 à 14 jours après expansion, puis diluez-les dans RPMI avec des antibiotiques à une concentration de 100.000 cellules par millilitre. Diluer 100 microlitres de cette dilution cellulaire avec 9,9 millilitres de milieu pour atteindre 1000 cellules par millilitre. Puis diluer un millilitre de cette dilution avec neuf millilitres de milieu à une concentration de 100 cellules par millilitre.
Pour plaquer 96 plaques de puits pour contenir une cellule par puits, mélangez doucement un millilitre de solution de 100 cellules par millilitre avec cinq millilitres de milieu d’état et quatre millilitres de milieu frais, dans un réservoir stérile de réaccentrage. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 microlitres de la dilution cellulaire respective par puits de nouvelles plaques inférieures rondes de 96 puits pour obtenir une et deux cellules par dilutions de puits. Empilez les 96 plaques de puits et couvrez chaque pile d’une plaque de six puits contenant trois millilitres de PBS par puits.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone, pendant trois semaines. Après avoir terminé l’incubation, confirmer visuellement la présence de colonies cultivées à l’aide d’une microscopie légère avec grossissement quatre fois, et marquer les puits avec des colonies cultivées. Resuspendez doucement les cellules d’une cellule bien marquée par le pipetage.
Transférer 100 microlitres de cette suspension cellulaire dans un puits de plaque inférieure ronde fraîchement préparée de 96 puits avec 100 microlitres de RPMI avec antibiotiques, par puits et répéter pour tous les puits marqués, mélanger délicatement par pipetting. Pour dupliquer la plaque, transférez 100 microlitres de cette suspension cellulaire dans une deuxième plaque vide à fond rond de 96 puits et répétez ce processus pour tous les puits marqués. Enfin, remplissez les puits vierges de 200 microlitres de RPMI avec des antibiotiques.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après que la plaque en double a incubé pendant 24 à 48 heures le dupliquer à nouveau en ajoutant 100 microlitres de RPMI avec des antibiotiques à chaque puits. Utilisez une pipette multicanal pour mélanger doucement et transférer 100 microlitres à chaque puits d’une nouvelle plaque à fond rond de 96 puits.
Placez l’une de ces deux plaques en double dans l’incubateur. Utilisez la deuxième des nouvelles plaques en double pour la cytométrie d’écoulement, en ajoutant d’abord cinq microlitres de PMA/Ionomycine Master Mix par puits, pour stimuler les cellules. Incuber pendant 24 heures et préparer les cellules pour la cytométrie d’écoulement tel que décrit dans le texte.
Portez toutes les cellules simples viables en fonction de la taille dans la dispersion vers l’avant et vers le côté. Analyser l’expression des gènes fluorescents par cytométrie de flux. Pour filtrer les clones unicellules par PCR, concevez les amorces P5 et P6 pour la projection de PCR en fonction de la séquence de reporter choisie, afin d’amplifier 500 à 800 paires de base de la séquence reporter.
Pour un contrôle positif pcr, concevoir des amorces P7 et P8 qui amplifie 630 paires de base d’un locus génomique de type sauvage et non ciblé. Concevoir une troisième paire d’amorce qui amplifie 500 à 600 paires de base de l’épine dorsale du vecteur de ciblage comme un contrôle pour l’intégration non spécifique des séquences dorsales de ciblage-vecteur. Une fois que les clones de la deuxième plaque en double se sont suffisamment développés, préparez-les au criblage pcr en centrifugant d’abord la plaque pendant 10 minutes à 300 G à température ambiante.
Enlever soigneusement le surnatant, en s’assurant de ne pas déranger la pastille cellulaire. Lavez les cellules avec 100 microlitres de PBS par pipetting doux, centrifugant la plaque pendant cinq minutes à 300 G à température ambiante. Retirer le PBS et ajouter 200 microlitres de tampon de lyse par puits.
Pipette doucement pour mélanger, et transférer la suspension à une nouvelle plaque PCR. Sceller la plaque avec un film de paraffine et incuber pendant une heure à 55 degrés Celsius dans un thermocycler. Après avoir centrifugé les débris cellulaires à la vitesse maximale pendant 10 minutes, transférez le supernatant sur une nouvelle plaque PCR.
Ajouter 10 microlitres de cette cellule lysate à chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits remplie de 110 microlitres de H2O distillé, par puits. Puis incuber pendant 10 minutes à 99 degrés Celsius dans un thermocycler, pour inactiver proteinase K.Utilisez 2 microlitres de cette cellule lysate comme un modèle et utiliser un mélange commercial PCR maître pour le criblage, le contrôle et l’épine dorsale PCR. Exécutez pcr pendant 38 à 40 cycles d’amplification PCR dans un format de 96 puits.
Utilisez cinq microlitres de produits PCR et exécutez-les sur un gel TAE agarose de 1,5 % pour analyser et combiner la cytométrie du débit et les résultats du PCR, afin de confirmer les clones à cellules simples. L’expression de gène de reporter après induction de PMA/Ionomycin a été confirmée par cytométrie de flux et PCR dans quatre à 12%de cellules, selon le site d’intégration. L’analyse PCR de l’ADN génomique à l’aide d’amorces pour la jonction d’intégration à cinq et trois premiers, confirme que des événements de ciblage se sont produits.
Après le criblage des clones de cellules simples pour le ciblage correct par cytométrie de flux, des clones avec l’expression élevée, basse et aucune expression fluorescente de gène de reporter ont été observés. Des clones de cellules simples ont également été confirmés par PCR à l’aide d’amorces spécifiques aux journalistes et d’amorces de contrôle. Des clones confirmés positifs dans le criblage pcr ont été dépensés et analysés plus loin pour le ciblage correct par la tache méridionale, utilisant une sonde reporter-spécifique et une liaison génomique-sonde à l’extérieur du journaliste.
Seule une partie a montré la taille correcte de bande dans l’analyse méridionale de tache et avait hétérozygously intégré le journaliste, montrant qu’il est important de vérifier des résultats de PCR par tache méridionale. Les clones ont également été analysés par séquençage pour confirmer davantage les clones positifs à cellules simples. Séquençage du site cible: allèle homologue, si le journaliste n’avait pas intégré, a révélé cas9 mutations induites.
Une fois maîtrisées, la génération de lignes de reporters sur le VIH peut se faire en deux à trois mois. Avant de cibler, il est important de passer suffisamment de temps à choisir un site d’intégration et un journaliste approprié, selon la question de recherche que vous souhaitez aborder. Les journalistes peuvent, par exemple, inclure différents éléments réglementaires sur le VIH si vous le souhaitez.
Suite à cette procédure, les lignées cellulaires peuvent par exemple être utilisées pour tester l’effet des différents agents en hausse de latence sur l’activité transcriptionnelle du reporter LTR, selon son site d’intégration. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des lignes de reporters vih spécifiques au site d’intégration pour la conception d’ARN guides et de vecteurs de ciblage, l’exécution de CRISPR / Cas9 basée sur l’ingénierie du génome dans les cellules jurkat, la production de clones à cellules individuelles et la sélection de clones correctement ciblés par FACS et pcr dépistage. N’oubliez pas que si vous choisissez de travailler avec un journaliste vih compétent en réplication, vous devez travailler dans des conditions de sécurité BSL3.
