Ce protocole décrit une technique de plate-forme pour isoler les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques. Ces cellules peuvent être utilisées, par exemple, pour obtenir d’autres informations sur les fonctions de la barrière musculaire du sang. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’il est possible d’isoler les cellules endothéliales microvasculaires primaires d’une grande pureté.
Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies musculaires à base immunitaire telles que l’interaction entre les cellules musculaires et endothéliales dans la santé et la maladie. Tout d’abord, préparez toutes les solutions nécessaires et les plaques de six puits décrites dans le protocole. Pour commencer la procédure pratique, obtenez une paire de ciseaux pointus/émoussés chirurgicaux, une paire de ciseaux pointus/pointus chirurgicaux, et des forceps droits et incurvés.
Désinfecter tous les instruments chirurgicaux avec 70% d’éthanol. Placez une souris mâle adulte euthanasié sur le dos et humidifiez les jambes avec 70% d’éthanol. À l’aide des ciseaux chirurgicaux pointus/contondants, couper chaque jambe entière en coupant à l’articulation de la hanche.
Placer les extrémités dans un plat de culture cellulaire fermée. Transférer le plat dans une hotte stérile d’écoulement laminaire. Utilisez des ciseaux pointus et des forceps incurvés pour couper la peau ouverte de la hanche à l’extrémité de l’orteil.
Utilisez les forceps droits pour tenir l’orteil ou la garniture de pied tout en utilisant les forceps incurvés pour peler la peau de l’orteil à la hanche. Pour isoler le musculus quadriceps femoris, couper le tendon du genou, et couper le muscle le long du fémur à la hanche. Couper le tendon d’Achille pour isoler le musculus triceps surae.
Ensuite, couper le long du tibia à la fossa popliteal et enlever le muscle. Pour enlever les tendons qui ne peuvent pas être dissociés, maintenez les muscles avec les forceps incurvés et coupez chaque tendon approprié. Ajouter 2 445 microlitres de solution de digestion préparée à un plat frais et étiqueté de culture cellulaire et déterminer le poids.
Transférez tous les morceaux musculaires dans ce plat. Ensuite, déterminez le poids. La différence des deux valeurs mesurées fournit le poids sec du tissu musculaire qui ne doit pas dépasser un gramme.
À l’aide des ciseaux pointus chirurgicaux, couper tout le tissu musculaire en petits morceaux. Incuber la suspension tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 1,5 heure, en s’assurant de mélanger soigneusement la suspension avec une seringue à insuline d’un millilitre toutes les 20 minutes pendant environ cinq minutes. Après l’incubation, transférer la suspension dans une passoire en nylon de 70 micromètres placée sur un tube étiqueté de 50 millilitres et recueillir le débit à travers.
Lavez la passoire cellulaire avec huit millilitres de DMEM et recueillez le flux à travers. Si les pièces branchent la passoire, réutilisez la solution dissociée. Jetez la passoire cellulaire et centrifugeuse la suspension à 300 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre d’un tampon de lysage de potassium de chlorure d’ammonium pour la lyse des globules rouges. Incuber à température ambiante pendant 30 secondes. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de DMEM contenant 10%FCS pour arrêter la réaction.
Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une chambre de comptage des cellules Neubauer pour déterminer les numéros de cellule. Pour commencer à épuiser les cellules CD45 positives, centrifugez la suspension à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 90 microlitres de tampon MCS. Ajouter 10 microlitres de microbilles DE CD45 et mélanger la suspension. Incuber au réfrigérateur à 4 à 8 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Après cela, ajouter un millilitre de tampon MCS. Centrifugeuse à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez complètement le supernatant et résuspendez les cellules dans 500 microlitres de tampon MCS.
Placez une grande colonne magnétique dans le champ magnétique du séparateur. Rincez le réservoir de la colonne avec trois millilitres de tampon MCS. Ensuite, placez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne pour recueillir le flux à travers.
Appliquez la suspension cellulaire entière sur la colonne et laissez-la couler complètement. Lavez la colonne trois fois en ajoutant trois millilitres de tampon MCS dans le réservoir pour chaque étape de lavage et en attendant que le réservoir de la colonne soit vide avant de commencer la prochaine étape de lavage. Recueillir les cellules non étiquetées en passant par la colonne pour une utilisation dans d’autres étapes de séparation.
Pour commencer à accumuler des cellules CD31 positives, utilisez une chambre de comptage cellulaire Neubauer pour déterminer les numéros de cellules. Ensuite, centrifuger les cellules non étiquetées à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille dans 90 microlitres de tampon MCS.
Ajouter 10 microlitres de microbilles DE CD31 et mélanger toute la suspension. Incuber au réfrigérateur à 4 à 8 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cela, ajouter un millilitre de tampon MCS et centrifugeuse à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Enlevez le supernatant et réutilisez les cellules dans 500 microlitres de tampon MCS. Placez la colonne magnétique moyenne dans le champ magnétique du séparateur. Rincez la colonne avec 500 microlitres de tampon MCS.
Ensuite, placez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne pour recueillir le flux à travers. Appliquez toute la suspension cellulaire sur la colonne et laissez-la couler complètement à travers. Lavez la colonne trois fois en ajoutant 500 microlitres de tampon MCS dans le réservoir pour chaque étape de lavage, et attendez que le réservoir de la colonne soit vide avant de commencer la prochaine étape de lavage.
Les cellules non étiquetées passant la colonne représentent la fraction CD45-négative, CD31-négative. Conservez-les pour d’autres contrôles de qualité. Ensuite, retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de collecte approprié.
Pipette deux millilitres de tampon MCS sur la colonne. Poussez immédiatement le piston dans la colonne pour rincer les cellules étiquetées magnétiquement. Cette fraction CD45-négative, CD31-positive représente les CE murines primaires enrichies.
Centrifuger la suspension cellulaire à 350 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez complètement le supernatant et résuspendez les cellules en un millilitre de milieu cellulaire endothélial. Transférer les cellules dans un seul puits d’une plaque de culture enduite de six puits contenant un millilitre de milieu cellulaire endothélial.
Pour la culture, incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur stérile, en s’assurant de rafraîchir le milieu tous les deux à trois jours. Lorsque les cellules sont à 80 à 90% confluent, rincer chaque puits contenant des cellules deux fois avec deux millilitres de PBS en deux étapes consécutives de lavage. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de trypsine EDTA solution à chaque puits et couvez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur stérile pendant trois à cinq minutes.
Après cela, ajouter 1200 microlitres de DMEM contenant au moins 10% FCS pour arrêter l’activité enzymatique. Centrifugeuse à 350 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, accumulez les cellules CD31 comme décrit précédemment pour augmenter la pureté.
Utilisez un champ lumineux ou un microscope à contrat de phase standard avec grossissement de 20 % et ouverture numérique de l’objectif de 0,35 pour observer la confluence cellulaire. Dans cette étude, les cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires primaires de muscle squelettique de murine sont isolées. Un jour après l’isolement, les MOC murines primaires et les autres cellules résiduelles forment des conglomérats et adhèrent au fond des plats de culture.
À partir du septième jour, on peut observer des cellules plates et allongées, mais la contamination d’autres cellules, principalement sphéroïdes, est encore visible. Ainsi, un autre cycle de sélection CD31-positif via MCS est nécessaire. Par la suite, les MOC murines primaires prolifèrent à une densité d’environ 80 à 90 % à la confluence, elles forment généralement un monocouche non superposé de cellules alignées longitudilement.
La prolifération s’arrête à la confluence en raison de l’inhibition du contact. Le contrôle de la qualité par cytométrie de débit montre des valeurs à la fois pour la viabilité et la pureté allant d’environ 70% chacune pour les cellules immédiatement après l’isolement. Les cellules cultivées après une autre sélection CD31-positive via MCS montrent des valeurs satisfaisantes pour la pureté ainsi que pour la viabilité, allant jusqu’à 95% chacune.
Les cellules obtenues sont ensuite étudiées pour l’expression génétique des gènes marqueurs cellulaires satellites musculaires jumelés protéine boîte 7 et M-cadhérine au niveau de l’ARNm par PCR quantitatif. Comme prévu, seules la fraction CD45-négative, CD31-négative ainsi que les cellules musculaires murines primaires différenciées ont exprimé la protéine de boîte 7 et M-cadhérine, tandis que CD45-négatif, CD31-positif et les MMC murines primaires sont négatifs pour ces marqueurs. Après la deuxième étape cd31 MCS, qPCR est utilisé pour évaluer l’expression des protéines de jonction serrées dans les MOC murines primaires confluentes.
On voit des MMECs murines primaires exprimer des niveaux élevés de claudin-5, d’occludin, et d’occludens-1 de zonula, tandis que pmMC montrent seulement une faible expression de zonula occludens-1. Cette technique peut être effectuée en cinq à six heures. Suivant ce protocole, d’autres méthodes telles que des analyses de migration ou des expériences de stress à bas cisaillement peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler les cellules endothéliales microvasculaires primaires des muscles squelettiques par la mécanique et la dissociation enzymatique et le tri des cellules magnétiques.
