Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), cellules en mouvement Cluster d&#39;excellence (EXC 1003 - CIM), l&#39;Université de Münster (SB et SGM) et par la Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 à SB et SGM). Nous remercions Heike Blum pour les excellentes illustrations.

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par les autorités locales (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; Recklinghausen, Allemagne&quot;) et menées conformément à la loi allemande de protection des animaux. 1. Observations générales pour l&#39;expérimentation de la souris <ol><li> Effectuer toutes les expériences utilisant des souris en conformité avec les directives du Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux respectif. </li><li> Gardez les souris dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes et leur permettre d&#39;avoir accès à la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Utilisez la souris âge et le sexe dans les groupes expérimentaux parce que les propriétés biologiques peuvent varier avec l&#39;âge et le sexe. </li><li> Chaque fois que possible, essayez de réduire, améliorer ou remplacer les expérimentations animales. </li></ol> 2. Préparation du gradient de Percoll <ol><li> Mélanger 19 ml de 1 x PBS avec 1 ml de PBS 10x, 1 ml de FCS et 10 ml de Percoll. </li><li> Effectuer sterile filtration dans un tube de verre (diamètre des pores du filtre: 0,2 pm). Ensuite conserver la solution à 4 ° C. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;endothélium cellulaire moyen et revêtement des plaques de culture cellulaire <ol><li> Moyenne des cellules endothéliales: <ol><li> Préparation de 500 ml de milieu: (Approx. 20%) Mélanger 400 ml de milieu DMEM (env. 80%) avec 100 ml PDS, 0,25 ml de bFGF (. 20 ug / ml, environ 0,05%), 0,5 ml d&#39;héparine (100 pl / ml; env. 0,1%) et 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml; env. 0,1%). Ajouter pyrumycin seulement pour milieu de culture cellulaire utilisé dans les 2 premiers jours de culture. </li><li> Effectuer une filtration stérile dans un tube de verre (diamètre des pores du filtre: 0,2 pm). Ensuite conserver la solution à 4 ° C. </li></ol></li><li> Revêtement de plaques de culture de cellule: <ol><li> Pour 1 ml de solution de revêtement, préparer une solution de 500 ul trou DDH 2 O, 400 pi de collagène IV (0,4 mg / ml) et 100 ul de fibronectine (0,1 mg / ml). </li><li> Couvrir toute la surface de l&#39;EACh puits de la plaque de culture de cellules avec la solution de revêtement. Conservez la plaque à 4 ° C pendant la nuit. </li></ol></li></ol> 4. L&#39;isolement de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau murin (MBMEC) <ol><li> Sacrifiez 10 souris adultes (8 - 12 semaines, C57BL / 6) par dislocation cervicale. Isoler Ensuite, les souris-cerveau et magasin dans 5 ml de PBS (Avertissement: travail stérile). </li><li> Retirer les tiges cerveau, le cervelet et du thalamus avec une pince. Détachez les méninges en roulant soigneusement le cerveau sur un papier buvard stérile. Recueillir les libres-méninges forebrains résultant. </li><li> Transférer le cerveau dans un tube Falcon de 50 ml rempli de 13,5 ml de DMEM. </li><li> Émincer le tissu, avec une première pipette de 25 ml, puis avec une pipette de 10 ml jusqu&#39;à ce que le support devient laiteuse. </li><li> Puis digérer le tissu avec un mélange de 0,6 ml de collagénase CLS2 (10 mg / ml dans du DMEM) et 0,2 ml de DNAse (1 mg / ml dans du PBS) en milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco pendant 1 heure à 37 ° C sur une orbitale secouerr à 180 rpm. </li><li> Ajouter 10 ml de DMEM ajoutés à la suspension de tissu et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant (Avertissement: PELLET est facile de perdre) </li><li> Pour retirer la myéline, la remise en suspension du culot avec une pipette de 25 ml dans 25 ml de DMEM-BSA (20% p / v) (env. 25 fois), et centrifuger à 1000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Jeter la couche de myéline supérieure (laiteux) avec un cassé pipette Pasteur en verre avec un diamètre plus grand, et puis jetez la couche de BSA avec une pipette Pasteur normale. </li><li> Reprendre le culot dans 9 ml de DMEM et ajouter 1 ml de collagénase / dispase (concentration finale est de 1 mg / ml) et 0,1 ml de DNAse. Digérer la solution pendant 1 heure à 37 ° C sur un agitateur orbital à 180 rpm (mise en garde: ne pas utiliser la pipette pour remettre en suspension - les cellules peuvent être perdues). </li><li> Au cours de la digestion, centrifuger la solution Percoll de mettre en place le gradient de densité en utilisant une ultracentrifugation à 3000 g pendant 1 h à 4 ° C, avec une accélération, wifrein Thout. </li><li> Ajouter 10 ml de DMEM à la suspension de cellules digérées. Centrifuger la suspension à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. Ensuite, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 2 ml de DMEM. </li><li> Ajouter les cellules remises en suspension avec soin sur le dessus du gradient de Percoll et centrifuger à 700 g pendant 10 min à 4 ° C sans freinage et accélération. Remarque: Les cellules sont visibles comme un nuage dans l&#39;interphase. </li><li> Prenez environ. 12 ml de cellules à l&#39;interphase avec une longue aiguille stérile et le placer dans un nouveau 50 ml Falcon avec 5 ml de DMEM. </li><li> Centrifuger les cellules à nouveau à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. Ensuite remettre en suspension le culot dans le milieu de cellules endothéliales (utiliser env. 0,2 ml de milieu par 1 cm 2 de surface de la cellule plaque de culture). </li><li> Retirer la solution de revêtement à partir de plaques revêtues de culture de cellules (voir étape 3.2) et rincer chaque puits avec du PBS stérile en deux étapes de lavage consécutives. </li><li> Maintenir des cultures de cellules endothéliales demilieu cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur stérile. Changer le milieu tous les deux à trois jours. Fractionner les cellules à 90% de confluence. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Dysfonctionnement sang-cerveau-barrière est une marque de diverses maladies délétères du SNC, par exemple une panne de la BHE dans la sclérose en plaques facilite largement l&#39;invasion du système nerveux central par les cellules immunitaires autoréactives et permet la rencontre et la destruction des oligodendrocytes. Dans un AVC ischémique la perturbation de la BHE et la formation subséquente de l&#39;oedème cérébral sont des facteurs essentiels qui influencent la croissance de l&#39;infarctus secondaire et la survie globale des patients 6. En outre, par des altérations de la BHE dans les régions éloignées des lésions ischémiques focaux sont capables d&#39;induire des altérations fonctionnelles généralisées du cerveau. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents sont largement inconnus 5. En revanche, la densité élevée et de la diversité des transporteurs d&#39;efflux dans BMECs fonctionnels réduit la concentration de médicaments utiles comme agents chimiothérapeutiques pour les tumeurs malignes du cerveau ou des antibiotiques pour les maladies infectieuses. Par conséquent, une meilleure compréhension de la cerveau-bar de sangrier fonction dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est nécessaire de développer des agents pharmacologiques qui sont capables de réguler spécifiquement la fonction de barrière dans la direction privilégiée 21. Fiable dans des modèles in vitro de la BHE sont des outils indispensables pour étudier les mécanismes de régulation de la BHE. De nombreuses lignées cellulaires immortalisées endothéliale du cerveau ont été créés et utilisés comme des modèles in vitro 22 BBB. Ces lignées cellulaires offrent certains avantages par rapport BMECs primaires à mesure qu&#39;ils grandissent plus vite et de garder certaines caractéristiques de BBB sur plusieurs passages. Cependant, les lignées cellulaires endothéliales ne peuvent se substituer entièrement à cellules primaires propriétés importants sont modifiés qui se mêlent à la transférabilité des résultats expérimentaux à la situation in vivo. Par exemple, la lignée de cellules endotheliales de cerveau murin bEnd.5 exprime uniquement de faibles taux de protéines de jonctions serrées répartis de façon discontinue conduisant à haute Paracperméabilité ellular 23. BEnd.3, une autre ligne fréquemment utilisé cellule endothéliale du cerveau de souris, démontre jonctions denses et continues distribués serrés, une résistance transendothéliale haut, plusieurs transporteurs d&#39;efflux et la faible perméabilité paracellulaire. Cependant, les couches de cellules bEnd.3 rapport à BMECs primaires manquent d&#39;une véritable discrimination à l&#39;égard de la pénétration de certains transcellulaire et substrats paracellulaires 24. Dans les préparations de cultures de cellules primaires, cellules contaminantes peuvent interférer de façon significative avec la validité des résultats expérimentaux. Dans le protocole décrit, pyrumicin est utilisée comme agent sélectif pour les cellules endotheliales d&#39;atteindre une pureté élevée. Cependant, un contrôle de la qualité régulière de la culture cellulaire est inévitablement nécessaire pour garantir des expériences fiables. Il existe plusieurs méthodes pour le contrôle de la qualité, en plus de propriétés morphologiques typiques des cellules endothéliales (voir figure 1A), la transendothelial résistance peut être mesurée ou l&#39;expression du marqueur de cellules endotheliales tels que CD31 (voir figure 1B) ou le facteur de von Willebrand (vWF) peut être évaluée. Le nombre de cellules endothéliales cérébrales isolées d&#39;un cerveau de souris est relativement faible et de mettre en place une culture de cellules approprié pour de multiples expériences, le cerveau de plusieurs souris doivent être mis en commun. Dans notre expérience, au moins 10 souris doivent être utilisées pour une expérience qui pourrait être un facteur limitant en fonction des ressources de l&#39;animalerie respectif. Afin d&#39;éviter les biais ou les facteurs de confusion, seules les souris avec un fond génétique et de l&#39;environnement devraient être mis en commun identique. En revanche, les bovins et les préparations de cellules endothéliales de cerveau de porc fournissent un grand nombre de cellules endothéliales de cerveau disponibles dans un cerveau. Cependant, outre la reproduction simple et le logement, le répertoire large et de plus en plus de souris transgéniques disponibles rend murine primaire BMECs comme un idéalmodèle pour étudier la fonction sang-cerveau-barrière. Plusieurs résultats importants concernant les fonctions de la BHE et les mécanismes moléculaires sous-jacents sont venus des études en 2D systèmes de culture de tissu. Récemment, des systèmes de culture en 3D ont été mis au point 25, où les cellules endothéliales sont placées dans une matrice de collagène qui leur permet de former la lumière et des réseaux tubulaires. Ces nouveaux systèmes de culture de cellules pour permettre une reproduction plus fidèle de processus vasculaires dans l&#39;organisme intact in vivo. L&#39;implication des autres cellules de l&#39;NVU en 3D des systèmes de culture cellulaire, tels que les péricytes et les astrocytes peut révolutionner l&#39;étude in vitro de la fonction hémato-encéphalique barrière; premiers modèles ont été développés récemment 26. Il ya quelques recommandations pour le dépannage. Tout d&#39;abord travail stérile est essentielle pour la qualité de la culture des cellules endothéliales. Deuxièmement, pyrumycin ne doit être ajouté pour cellulairemilieu de culture utilisé dans les 2 premiers jours de culture, plus l&#39;application peut conduire à la mort cellulaire accrue MBMEC et la fonction barrière de faible qualité. Troisièmement, les enzymes utilisées dans ce protocole doivent être utilisées et stockées selon les instructions du fabricant; autrement leur bon fonctionnement peut être compromise. En outre, le revêtement de plaques de culture de cellules peut être modifié si les cellules endothéliales ne se fixent pas. Les concentrations de la fibronectine et du collagène peuvent être modifiées ou d&#39;autres protéines de la matrice peuvent être ajoutés à la solution de revêtement. Enfin, l&#39;âge, le sexe, la saison de l&#39;année et les conditions environnementales au sein de l&#39;animalerie sont des facteurs importants qui pourraient influer sur la qualité de MBMEC isolement et la comparabilité des expériences. Il faut veiller à ce que les conditions sont comparables entre expériences indépendantes. Le protocole décrit doit être considéré comme une méthode de base pour isoler neuroimmunologiques BMECs murins. Les cellules isolées peuvent être used pour une grande variété d&#39;applications pour mieux comprendre en fonction BBB, comme les essais de migration, gène et les études d&#39;expression de protéines, des évaluations ou des expériences électrophysiologiques de perméabilité. Comme mentionné ci-dessus, 3D systèmes de culture de cellules de BMECs pourraient offrir de nouvelles possibilités pour étudier les mécanismes complexes impliqués dans la régulation de la BHE dans le contexte de la NVU. Par conséquent, l&#39;isolement de cellules endothéliales primaires restera une technique précieuse dans le domaine de la recherche BBB dans l&#39;avenir.

<html> microvasculaires du cerveau des cellules endothéliales (BMEC) monocouches de forme qui sont une partie intégrante de la barrière sang-cerveau-barrière hautement spécialisée (BBB). BMECs sont reliées entre elles par des protéines de jonction fixées à une membrane basale. Ensemble avec les péricytes, les cellules musculaires lisses, les pieds astrocytaires d&#39;extrémité et des globules circulant elles accumulent l&#39;unité neurovasculaire dite (NVU) 1. Contre la notion précédente d&#39;une barrière imperméable entre le sang et le-du système nerveux central (SNC), la NVU est une interface dynamique, hautement spécifique et réglementé qui contrôle le passage des fluides, des molécules et des cellules entre les vaisseaux sanguins cérébraux et du système nerveux central 2 . Un dysfonctionnement ou dérèglement de la NVU peuvent initier et / ou contribuer à une variété de neurovasculaires, les maladies infectieuses, inflammatoires ou dégénératives du système nerveux central, tels que l&#39;AVC ischémique, le VIH-encéphalopathie, la sclérose en plaques, maladie de Parkinson 3-6 Alzheimer ou. _content &quot;&gt; La monocouche BMEC est hermétiquement fermé par un complexe de jonction constitué de serré (TJ) et jonctions adhérentes (AJ) 7. La résistance électrique élevée et la faible perméabilité paracellulaire de la BHE sont principalement basées sur les protéines TJ 8. Les JT sont les complexes formés par les protéines transmembranaires de la famille de la claudine et occludine, qui sont liés au cytosquelette des cellules endotheliales par des molécules d&#39;adaptateurs, tels que les zonulaoccludens (ZO) des protéines ZO1-3 4. jonctions adhérentes sont essentiellement assemblés par la protéine membranaire intégrale l&#39;endothélium vasculaire (VE) -cadherin, qui est lié au cytosquelette via caténines 8. La fermeture hermétique de la BHE empêche le libre échange des substrats et des cellules entre le sang et le LCR. Les exceptions à cette règle sont lipophiles, les petites molécules ayant un poids moléculaire &lt;400 Da, qui sont capables de traverser la BHE par médiée par des lipides diffusion 9. Le passage d&#39;une plus grande et / oumolécules hydrophiles, tels que le glucose, les acides aminés, les peptides, les protéines et de nombreux médicaments est limitée à des systèmes hautement contrôlées transcellulaires de transport 10, qui peuvent être classés en cinq grandes catégories: le transport de porte-médiation, le transport d&#39;ions, le transport d&#39;efflux actif, médiée par le récepteur transports, et caveolae-transport médié par 4. Ces systèmes de transporteur permet le maintien de l&#39;homéostasie du système nerveux central, qui est nécessaire pour la production d&#39;un signal précis, la transduction et l&#39;intégration. En outre, BMECs sont capables de contrôler activement le passage de molécules distinctes par l&#39;expression d&#39;une variété de ectoenzymes. Ces enzymes sont localisées sur la surface cellulaire et de modifier des substrats endogènes et exogènes spécifiques empêchant ou en permettant le passage de la barrière hématoencéphalique 11. Alors que le CNS a été considéré comme un organe immunitaire privilégié pour un long temps, des découvertes récentes suggèrent un système plutôt dynamique et bien réglementé de surv immunitairequ&#39;une procédure du système nerveux central. Les BMECs sont gravement impliqués dans la régulation de la transmigration des cellules immunitaires. Par l&#39;expression des sélectines sur les lymphocytes de surface sont induites sélectivement pour fixer de manière lâche à l&#39;endothélium. La sécrétion de chimiokines qui se heurtent à des récepteurs spécifiques sur les leucocytes conduit à l&#39;expression ou de changements de conformation des intégrines leucocytaires telles que LFA-1 (fonction lymphocytaire antigène-1 associé) et VLA-4 (antigène très tardif 4). Les intégrines la médiation d&#39;une adhésion ferme par leurs counterreceptors endothéliales, par exemple, VCAM-I (vasculaire molécule d&#39;adhésion cellulaire), ICAM-I (molécule d&#39;adhésion intercellulaire) permettant la transmigration dans le parenchyme cérébral entre ou à travers BMECs du 12-14 BBB contraignant. Ces résultats et d&#39;autres soulignent le rôle actif de l&#39;endothélium dans la régulation de la migration elle-même des cellules immunitaires. En outre, BMECs dans le cadre de la NVU est impliquée dans la régulation de la li débit sanguin cérébralnked aux demandes métaboliques neuronaux locaux. Lors de la stimulation des cellules endotheliales astrocytaire produisent des substances vasoactives telles que l&#39;oxyde nitrique conduit à la relaxation des cellules musculaires lisses vasculaires 15. L&#39;angiogenèse et la neurogenèse dans le développement ainsi que dans le cerveau adulte présente des motifs et le développement parallèle et partagent beaucoup de propriétés de régulation 1, 4. Les cellules endothéliales sont gravement impliqués dans ces processus 16, 17. En résumé, BMECs fournir les caractéristiques essentielles pour justifier un bon développement et fonctionnement du SNC. BBB dysfonctionnement est lié à de nombreux troubles neurologiques graves. Cependant, très peu de cibles ont été identifiées à l&#39;interface cerveau-vasculaire pour un traitement spécifique et efficace 18. Simplifiée des modèles in vitro ont été utilisées pour comprendre les mécanismes impliqués dans la fonction et la régulation des systèmes physiologiques complexes pour un lotemps ng. L&#39;isolement comme décrit par ce manuscrit et l&#39;étude in vitro de souris BMECs, étant donné la grande variété de souris knock-out spécifique-souches, pourrait permettre une meilleure compréhension de la fonction BBB et de la réglementation dans des conditions physiologiques et physiopathologiques ouverture de nouvelles voies thérapeutiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bFGF</td>
			<td style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-18B</td>
			<td style="width:331px;">Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BSA</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9418</td>
			<td>Bovine serum albumine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase CLS2</td>
			<td style="width:133px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004176</td>
			<td>High relative level of protease activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagenase-dispase</td>
			<td style="width:133px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:123px;">10269638001</td>
			<td style="width:331px;">Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagen IV</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0543</td>
			<td style="width:331px;">From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5030</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DNAse</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F6178</td>
			<td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3393</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PDS</td>
			<td style="width:133px;">First Link UK Ltd.</td>
			<td style="width:123px;">60-00-850</td>
			<td>Plasma-derived serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Percoll</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1644</td>
			<td>Warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pyrumycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td>Should only be used in first 2 d of culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Immédiatement après l&#39;isolement, BMECs murines et des cellules contaminantes forment des conglomérats qui flottent dans le milieu de culture de cellules (Figure 1A, jour 0). Le traitement avec pyrumycin conduit à une sélection de BMECs murins car elles expriment des niveaux élevés de transporteurs d&#39;efflux tels que les P-glycoprotéine qui conduit à une résistance par rapport à des toxines. Cellules contaminantes sont beaucoup plus sensibles à la cytotoxicité à médiation pyrumycin 19. Pendant le processus de sélection pyrumicin, cellules contaminantes entrent mort cellulaire par apoptose ou nécrose, alors que MBMECs commencent à fixer au collagène IV / fibronectine enduit culture cellulaire plaques (figure 1A, jours 1 et 2). Jusqu&#39;à ce jour 5, les MBMECs prolifèrent jusqu&#39;à une densité d&#39;env. 80 - 90%. Ils sont caractérisés par l&#39;aspect typique en forme de fuseau. A confluence, elles forment une monocouche de serrés, alignés longitudinalement et les cellules de contact inhibée sans chevauchement (figure 1A, le jour 5). Parsélection pyrumicin, un haut degré de pureté de 99% MBMEC est atteint comme en témoigne le marqueur CD31 des cellules endothéliales (PECAM1, figure 1B). Les MBMECs forment bien monocouches étanches reliés entre eux par des protéines des jonctions serrées. Après 7 - 8 jours de culture, les couches de cellules endothéliales accumulent des valeurs stables pour la résistance électrique (atteignant des valeurs typiques entre 20 à 30 Ω x cm 2). Et la capacité (figure 1C) À ce point dans le temps des tests fonctionnels tels que Cell- expériences de migration 3, 20,21 et perméabilité des tests, par exemple avec du bleu d&#39;Evans ou de dextran, doivent être effectuées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. morphologique et les propriétés fonctionnelles de murin BMECs. (A) évolution dans le temps représentant de BMECs culture consultés par micro lumière de transmissionSCOPY plus de 5 jours. La barre d&#39;échelle est valable pour toutes les images. (B) coloration par immunofluorescence pour le endothéliale marqueur de cellules CD31 au jour 5. CD31 (vert) et DAPI (bleu). (C) Les cellules ont été pré-cultivés pendant 5 jours et ensuite transférés à un système automatisé pour la l&#39;analyse des propriétés biophysiques (résistance et capacité). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K vues.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Vidéo: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Recherche

Neurosciences

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.