Cette méthode permet de comparer l’activité cytotoxique de différents types de cellules en utilisant une méthode simple et peu coûteuse qui ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas l’utilisation de matières dangereuses, qu’elle est peu coûteuse et qu’elle ne nécessite pas l’utilisation d’équipement spécialisé. Cette méthode peut être appliquée pour mesurer l’activité cytotoxique d’autres types de cellules telles que cd8 plus les cellules cytolytiques ou même pour évaluer la mort spontanée des cellules sans incubation, sans cellules effectrices cytolytiques.
Les personnes nouvelles à cette technique auront probablement du mal avec l’optimisation du rapport cellule cible-effecteur. Mon conseil est de faire une recherche approfondie de la littérature pour déterminer les ratios que vous testeriez lors de l’optimisation du protocole. Bien que cette méthode ne nécessite pas de compétences spécialisées, autres que le pipetage avec précision, l’isolement des cellules mononucléaires et la configuration de la plaque d’essai sont des étapes qui peuvent être mieux comprises et imitées si elles sont observées visuellement.
Chelsea Jekelley, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, ajouter 13,5 millilitres de RPMI en 1,5 millilitres de FBS à une boîte de Petri contenant un filtre de 100 micromètres. Placez un placenta sur le filtre et utilisez le côté plat d’un piston à seringues pour le pousser à travers le filtre et dans la boîte de Pétri.
Ensuite, établissez trois tubes coniques de 15 millilitres pour chaque tissu. Ajouter trois millilitres de gradient de densité moyen à chaque tube, et lentement superposer cinq millilitres de placenta homogénéisé dans chaque tube. Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant 25 minutes sans pause.
Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour recueillir la fine couche blanche buffy. Ajouter 10 millilitres de RPMI aux couches buffy combinées. Centrifugeuse à 300 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et jeter le supernatant.
Tout d’abord, suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 50 microlitres de PBS glacé. Ajouter l’anticorps CD3 étiqueté biotine selon le protocole du fabricant et bien mélanger avec une pipette. Placer le tube dans un rotateur à tube et incuber à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, ajoutez un millilitre de RPMI. Centrifugeuse à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en un millilitre de RPMI.
Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, mélanger la suspension cellulaire avec 150 microlitres de perles magnétiques. Transférer le tube dans un rotateur à tube et faire pivoter pendant l’incubation à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, récupérez le tampon de libération et laissez-le atteindre la température ambiante dans un coffret de sécurité biologique.
Une fois l’incubation terminée, placez le tube dans l’aimant pendant une minute. Recueillir le supernatant et sauver la population de cellules négatives CD3 dans un tube de 15 millilitres sur la glace. Retirer le tube de l’aimant, ajouter un millilitre de RPMI et utiliser une pipette pour mélanger les cellules et les perles cinq fois.
Ensuite, placez le tube dans l’aimant pendant une minute. Recueillir le supernatant et sauver la population négative cd3 dans un tube de 15 millilitres sur la glace. Centrifuger la population négative de CD3 des cellules à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 50 microlitres de PBS glacé. Après cela, ajouter biotine étiqueté cd161A anticorps aux cellules négatives CD3, selon les instructions du fabricant et bien mélanger. Placer le tube dans un rotateur à tube et incuber à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, ajoutez un millilitre de RPMI et centrifugeuse à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en un millilitre de RPMI et combinez-la avec des perles magnétiques dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Placez le tube dans le rotateur du tube et faites pivoter pendant l’incubation à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, placez le tube dans l’aimant pendant une minute. Recueillir le supernatant et jeter les cellules négatives CD3 négatives CD161A. Retirer le tube de l’aimant, ajouter un millilitre de RPMI et bien mélanger.
Placez le tube dans l’aimant pendant une minute, en vous assurant de recueillir le supernatant et de jeter les cellules négatives CD3 CD161A négatives. Après cela, retirez le tube de l’aimant et ajoutez un millilitre de tampon de dégagement de température ambiante. Placer le tube sur un rotateur à tube et faire pivoter pendant l’incubation pendant 15 minutes à température ambiante.
Ensuite, placez le tube dans l’aimant pendant une minute. Recueillir le supernatant dans un nouveau tube conique de 15 millilitres sur glace. Retirer le tube de l’aimant, ajouter un millilitre de température ambiante RPMI et bien mélanger.
Placez le tube sous l’aimant pendant une minute, en vous assurant de recueillir le supernatant dans le même tube conique de 15 millilitres. Bien mélanger et prendre un échantillon de 20 microlitres pour compter les cellules. Centrifuger les cellules à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Retirez le supernatant et suspendez à nouveau les cellules du RPMI. Ensemencer les cellules dans une plaque de six puits à une concentration de 300 000 cellules par puits dans 2,5 millilitres de média d’activation cellulaire NK. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié pendant 48 heures.
Dans une hotte, utiliser une pipette sérologique pour transférer les cellules YAC1 dans les médias dans un tube de 50 millilitres sur la glace et bien mélanger. Prenez un aliquot de 20 microlitres pour compter les cellules. Faites tourner les cellules à 300 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
À l’aide d’une pipette sérologique, recueillir le supernatant de la cellule NK précédemment préparée six plaque de puits dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez de la trypsine EDTA à chaque puits. Appuyez sur la plaque et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius.
Une fois que les cellules ont incubé avec de la trypsine EDTA pendant environ cinq minutes, utilisez un grattoir stérile pour gratter la plaque. Ajoutez ensuite un millilitre de médias cellulaires NK à chaque puits. À l’aide d’une pipette sérologique, recueillir les cellules et les médias et les transférer dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Prenez un aliquot de 20 microlitres pour compter les cellules. Centrifuger les cellules NK à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Tout d’abord, obtenir un fond rond, la culture traitée 96 plaque de puits et de le mettre en place comme décrit dans le tableau un du protocole de texte.
Centrifugeuse la plaque d’essai à 250 fois G pendant quatre minutes pour être certain que l’effecteur et les cellules cibles sont en contact. Ensuite, incuber la plaque dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq heures. 45 minutes avant la récolte des supernatants, ajouter 10 microlitres de solution de lyse 10X aux puits de libération LDH maximum de la cellule cible et remettre la plaque dans la chambre humidifiée.
Lorsque l’incubation est terminée, centrifuger la plaque à 250 fois G pendant quatre minutes, puis utiliser un pipetter multicanal pour transférer 50 aliquots microliter de chaque puits à une fraîche 96-puits, plaque d’analyse de fond plat. Ajouter 50 microlitres de réaccente d’analyse à chaque puits de la plaque d’essai. Couvrir la plaque de papier d’aluminium pour la protéger de la lumière et l’incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
Après cela, ajouter 50 microlitres de Stop Solution à chaque puits. Assurez-vous de lire la plaque dans l’heure qui suit l’ajout de la solution Stop et enregistrez l’absorption à 490 nanomètres. Les cellules NK placentaires obtenues à partir de rats NP et RUPP sont incubées pendant cinq heures avec des cellules cibles dans leurs médias respectifs à un rapport de 50:1.
Les données brutes d’absorption enregistrées à 490 nanomètres sont présentées ici. L’absorption moyenne du milieu culturel et les puits de contrôle de correction du volume sont calculés, et ces moyennes sont soustrayées des puits appropriés indiqués dans le protocole du fabricant. Les valeurs corrigées sont ensuite utilisées pour obtenir la cytotoxicité en utilisant le protocole fourni par le fabricant.
Bien que cette méthode ne nécessite pas de compétences spécialisées, autres que le pipetage avec précision, l’isolement des cellules mononucléaires et la configuration de la plaque d’essai sont des étapes qui peuvent être mieux comprises et imitées si elles sont observées visuellement. Après l’isolement des cellules NK, un certain nombre d’autres procédures pourraient être effectuées, telles que des expériences de co-culture pour déterminer le rôle des cellules nk placentaires dans l’attribution à la migration trophoblaste pendant la grossesse. Nous recueillons également les médias à partir des cellules NK élargies pour évaluer la cytokinase sécrète à partir des cellules stimulées différemment.
La pureté des cellules isolées pourrait également être évaluée par cytométrie d’écoulement.
