Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral allemand de l&#39;Éducation et de la Recherche (Bernstein Focus pour Neurotechnology accorder 01GQ0810, à T. Moser, et MED-EL Allemagne); la Fondation allemande pour la recherche par le Centre pour l&#39;échelle nanométrique Microscopie et physiologie moléculaire du cerveau (FZT 103, T. Moser) et par la SFB889, N. et T. Moser Strenzke).

Toutes les expériences présentées dans cet ouvrage ont été menées avec les normes éthiques définies par la loi allemande sur la protection des animaux de laboratoire. L&#39;Université de Goettingen conseil pour le bien-être des animaux et le bureau de la protection des animaux de l&#39;état de Basse-Saxe ont approuvé les expériences. 1 Préparation de μLED-stimulateur <ol><li> Pour μLEDs, d&#39;abord préparer le stimulateur μLED. Utilisez LED bleues avec 200 par 200 um surface active (μLED, voir le tableau des matériaux). </li><li> Souder les fils à la μLED. Ensuite, encapsuler le μLED et les connexions à l&#39;aide de la colle époxy. Laissez la nuit de l&#39;appareil pour permettre la guérison époxy. </li><li> Pour une stabilité mécanique et une isolation électrique des fils d&#39;entonnoir au moyen d&#39;un capillaire en verre mince, en utilisant de 1 mm de diamètre extérieur des capillaires en borosilicate et sceller la jonction avec de l&#39;époxy (figure 1D), de sorte que le tube capillaire peut être monté sur un manipulateur mécanique. REMARQUE: Tici est un compromis de faire de la capsule assez épaisse pour obtenir une bonne isolation électrique (en évitant les artefacts de stimulation), mais assez mince pour laisser la LED se déplacer librement à l&#39;intérieur de la bulle et pour la placer sur la cochléostomie. C&#39;est une bonne pratique pour préparer plus d&#39;une LED. </li><li> Pour confirmer une bonne isolation électrique, d&#39;abord préparer une boîte de Pétri avec 0,9% de NaCl et dip 3 fils de cuivre nus terminés dans le liquide. Cela sert à simuler un animal avec des électrodes ABR. Connecter les fils de l&#39;ABR-amplificateur et de là à un oscilloscope. </li><li> Ensuite, la LED sur le stimulateur et le plonger dans la solution jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit totalement couverte. Conduisez la LED avec des impulsions (voir l&#39;étape 3.1.1) au permis maximale du courant de plus de 20 minutes et vérifier les artefacts de stimulation. Si elles apparaissent, jeter le LED et essayer une nouvelle. </li></ol> 2. procédure chirurgicale <ol><li> Utilisez 4-10 souris transgéniques exprimant une semaine vieux ChR2 sous le promoteur de Thy1.2 (ligne 9dans Wang et al. 13). Pour manipuler l&#39;animal et effectuer la chirurgie, toujours utiliser des outils chirurgicaux propres et bien identifiés. </li><li> Anesthésier les animaux par une injection ip d&#39;un mélange d&#39;uréthane (1,32 mg / kg), de xylazine (5 mg / kg), et la buprénorphine 0,1 mg / g dilué dans 0,9% de solution stérile de NaCl et placer la souris sur une plaque chauffante pour maintenir le corps température à 37 ° C. Avec cette dose, l&#39;anesthésie dure généralement pour l&#39;ensemble du protocole expérimental. <ol><li> Dès le 10 min après l&#39;anesthésie chèque initial d&#39;induction des signes d&#39;excitation par le réflexe de retrait de la patte. En cas de mouvements, appliquer des doses d&#39;entretien de l&#39;uréthane (0,66 mg / kg) et de la buprénorphine (0,05 mg / g) dilué dans 0,9% de solution de NaCl stérile (sans xylazine). Encore une fois vérifier le réflexe de retrait de la patte et procédez seulement si le réflexe est absent. </li></ol></li><li> Raser soigneusement la zone rétro-auriculaire en préparation de l&#39;incision. Utilisez un rétro-auriculaireapprocher d&#39;atteindre la bulle (cavité de l&#39;oreille moyenne contenant de l&#39;air). <ol><li> Avec une pince micro disséquer avec soin et / ou de supprimer une partie des muscles du cou, par exemple, platysma, sterno, et scalènes. </li><li> Trouvez et exposer la bulle (figure 1A). Identifier la bulle comme une structure osseuse avec une forme sphérique caractéristique d&#39;un anneau sur la surface de la bulle indique que l&#39;insertion de la membrane tympanique (Figure 1A). Faire un trou avec la pointe d&#39;une aiguille d&#39;insuline juste en dessous de cet anneau. Commencez par là, retirer l&#39;os qui couvre la bulle d&#39;une amende Rongeur (rongeur) ou microforceps de manière à ce que le promontorium de la cochlée est exposée (figure 1B). </li></ol></li><li> Pour la cochléostomie, raser doucement la capsule osseuse pour ouvrir une petite fenêtre (cochléostomie: ~ 500-800 um), en prenant soin de laisser intact le labyrinthe membraneux (figure 1B). Effectuer le cochléostomie sur la deuxième cochléairetourner car il est assez loin de l&#39;artère stapédienne et de l&#39;apex. Ouverture des apex pourrait produire une rupture de la cochlée, y compris une fracture de la columelle. </li><li> Pour une fenêtre ronde insertion d&#39;une fibre optique ou μLED-implant à la rampe tympanique, agrandir attentivement la fenêtre ronde en grattant la niche osseuse avec la pointe d&#39;un scalpel (un certain nombre de lame 11 est une bonne option). Toujours utiliser une nouvelle lame ou d&#39;un scalpel. Soyez très prudent que l&#39;artère stapédienne passe très près de la fenêtre ronde (figure 1B). </li></ol> 3. optique de stimulation en utilisant deux approches <ol><li> Pour la stimulation transcochléaire, utilisation μLEDs ou une fibre laser couplé. <ol><li> Montez le capillaire portant la μLED sur un manipulateur mécanique et soigneusement positionner le μLED sur le cochléostomie. Utilisation oABR, provoquée par la stimulation de longue 10.3 msec à partir d&#39;une source de courant (typiquement 5-40 mA à 2,7 V) à 5.1 Hz, comme un moyen d&#39;optimiser la position et ouientation du μLED. </li><li> Pour la stimulation laser, utilisez un nm laser continu 473 et une fibre optique de 250 um (voir Matériaux). Couple la fibre optique à une source de laser bleu qui offre idéalement commande analogique rapide de puissance (sinon utiliser un dispositif acousto-optique ou une obturation rapide pour définir le stimulus optique). L&#39;aide d&#39;un micromanipulateur, recherchez la pointe de la fibre directement sur le cochléostomie et y fixer avec du ciment (stimulation transcochléaire) dentaire. </li></ol></li><li> Pour la stimulation intracochléaire, insérer la fibre à travers la fenêtre ronde dans la rampe tympanique. Ensuite, utilisez 3-10 impulsions laser ms de 10-30 mW (puissance de sortie de la fibre) à 1-5 Hz à obtenir oABR. La grande amplitude de oABR permet à l&#39;expérimentateur d&#39;observer oABR provoquée par des stimuli individuels sur l&#39;oscilloscope afin d&#39;optimiser la position et l&#39;orientation de l&#39;émetteur (μLED ou fibre) en utilisant oABR amplitude comme une sortie lu. </li><li> Une fois bien oABR ont été atteints, fixer la fibre avec cyanoacrcolle ylate ou ciment dentaire et d&#39;attendre jusqu&#39;à ce que la colle est solide. NOTE: Il est normal d&#39;observer un peu de liquide sortant de la cochlée. Cependant, pour éviter les problèmes avec la polymérisation du ciment, il est conseillé de sécher la région à l&#39;aide de fines mèches de coton. </li></ol> 4. enregistrements de oABR <ol><li> Insérez électrodes aiguilles sous le pavillon de l&#39;oreille, sur le sommet et sur le dos près des jambes et de les connecter à l&#39;amplificateur. </li><li> Amplifier le potentiel de différence entre le sommet et la mastoïde aiguilles hypodermiques. Échantillon à une vitesse de 50 kHz et de filtrage (1-10,000 Hz). Visualiser la différence de potentiel sur un oscilloscope idéalement à proximité de l&#39;installation d&#39;enregistrement pour optimiser la position de l&#39;appareil de stimulation optique. Utilisez étalement du signal (50-1,000x) et de stocker les données sur un ordinateur pour une analyse hors ligne. </li></ol> 5. enregistrements de potentiels évoqués optiquement terrain local <ol><li> Placez l&#39;animal dans un cadre stéréotaxique. En utilisant des pinces centrallye tirer la peau recouvrant le crâne et effectuer une incision médiane avec des ciseaux qui s&#39;étend approximativement d&#39;entre les yeux au point où les muscles du cou se fixent sur le crâne. <ol><li> Refléter la peau latéralement. Couper le périoste de la longueur le long de la suture sagittale et retirer latéralement en frottant doucement l&#39;os crânien exposée avec un coton-tige. </li></ol></li><li> Positionner une plaque de métal sur mesure sur le crâne exposé en laissant un espace d&#39;environ 1 mm entre l&#39;extrémité caudale de la plaque et lambda. Avec un diamètre de 0,7 mm percez soigneusement percer un trou dans l&#39;os pariétal. </li><li> Vissez doucement dans une vis de 0,85 mm de diamètre - pour servir de référence pour les potentiels enregistrés dans le colliculus inférieur (IC) - en maintenant la vis avec une pince aussi longtemps que la vis n&#39;est pas solidement fixé. Assurer un bon contact entre la vis et dure sans pénétrer dans le cerveau. Coller la vis et la plaque de métal sur le crâne avec de la colle cyanoacrylate. </li><li> Desserrer le neck muscles en douceur du crâne. Tirez sur les muscles du cou caudale pour environ 1-2 mm. Identifier l&#39;intersection du sinus sagittal supérieur (SSS) et le sinus transverse (TS). Si nécessaire, augmenter la transparence du crâne en humidifiant l&#39;os avec une solution physiologique de NaCl. <ol><li> Identifier l&#39;IC chez la souris que se trouve directement caudale à l&#39;intersection SSS et TS. Après l&#39;identification de l&#39;emplacement de l&#39;IC lentement et soigneusement effectuer une trépanation environ s&#39;étendant 0,5 mm à 1,5 mm rostralement caudale de la TS et environ 3 mm latéralement. </li><li> Éviter toute blessure à la SSS et TS comme ceux-ci empêcherait une expérience réussie. Ici, vérifier si l&#39;os trépané s&#39;est desserrée par doucement pousser. Aide d&#39;une pince soulever lentement l&#39;os. </li></ol></li><li> Avec un adaptateur approprié joindre un réseau multicanal et headstage sur un micromanipulateur. Pour éviter la destruction de l&#39;ensemble de l&#39;enregistrement multicanal lors de l&#39;insertion dans l&#39;IC, retirez soigneusement la dureavec une extrémité recourbée d&#39;une petite aiguille hypodermique commençant à proximité d&#39;un bord de l&#39;os. <ol><li> Retirer l&#39;animal du cadre stéréotaxique. Fixer la plaque de métal sur une barre de rester fixation stéréotaxique. Placez la sonde d&#39;enregistrement sur l&#39;IC et l&#39;insérer sous contrôle microscopique tels que le plus haut canal est à peine visible à la surface. </li></ol></li><li> Amplifier le potentiel de différence entre les canaux individuels de la matrice d&#39;enregistrement et de référence de la vis dans l&#39;os pariétal, l&#39;échantillon à une vitesse de 32 kHz, le filtre passe-bas (300 Hz) et à stocker sur un ordinateur pour une analyse hors ligne. </li><li> Tous les animaux doivent être euthanasiés à la fin de la procédure préalable à la reprise anesthésie conformément aux directives pertinentes de l&#39;euthanasie. Les méthodes d&#39;euthanasie appropriées peuvent comprendre dislocation cervicale ou inhalation de CO 2. </li></ol>

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R., Peca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Transgenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li><li>Tomita, H., Sugano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Properties+of+Transgenic+Rats+Harboring+the+Channelrhodopsin-2+Gene+Regulated+by+the+Thy-1.2+Promoter.">Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter.</a> PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les expériences décrites démontrent la stimulation des optogenetic Sgns, et peuvent, en principe, également être utilisés pour stimuler les cellules ciliées internes et / ou externes, à condition que l&#39;expression des opsines. Ces expériences nécessitent beaucoup de patience et de soins. Comme mentionné précédemment, les étapes les plus critiques sont une bonne cochléostomie / insertion autour de la fenêtre ainsi que la position et l&#39;orientation appropriée de la source de lumière. <p class="...

Selon l&#39;Organisation mondiale de la santé, 360 millions de personnes dans le monde souffrent de déficience auditive. Chez les sujets sourds, la stimulation électrique directe de Sgns par IC permettre ouvert compréhension de la parole dans la majorité d&#39;entre eux 1,2,4,5. Même si les IC ont été implantés dans plus de 200.000 personnes, étant ainsi le neuroprosthesis plus de succès, le codage de son entraînée par les implants cochléaires actuels est limitée. IC sont basés sur la stimulation électrique par un certain nombre d&#39;électrodes, où chacune une région active un tonotopique du nerf auditif contournant ainsi l&#39;organe de Corti dysfonctionnement sensoriel dans la cochlée. Auditeurs normo-entendants peuvent distinguer plus de 2000 fréquences, mais les IC d&#39;aujourd&#39;hui utilisent seulement jusqu&#39;à 12-22 canaux de fréquence 4. Cela est dû à la circulation du courant de chaque électrode généralisée stimulant 7,9, l&#39;activation d&#39;un grand nombre de Sgns qui représentent 8,15 nombreuses fréquences sonores différentes. Celimitation peut être améliorée en utilisant une stimulation multipolaire mais au détriment de la consommation d&#39;énergie supérieure 16,17. Leur dynamique de sortie de l&#39;intensité sonore est également limitée, généralement inférieure à 6-20 dB 4,18. Pour ces raisons, l&#39;amélioration de la fréquence et la résolution d&#39;intensité sont des objectifs importants pour augmenter les performances du CI pour améliorer la reconnaissance vocale dans des environnements bruyants, la compréhension et la prosodie perception de la musique. Une option différente pour stimuler le nerf auditif est la stimulation optique. La lumière peut être facilement porté à cibler une petite population de SGN, promettant un meilleur confinement spatial, augmentant la résolution de fréquence et également d&#39;élargir la plage dynamique, résultant en une meilleure résolution d&#39;intensité. En effet, la stimulation cochléaire avec de la lumière infrarouge a montré une excellente résolution de fréquence dans des modèles animaux 10,11,19. Un inconvénient de ce type de stimulation est qu&#39;il nécessite des énergies plus élevées que la stimulation électrique <sup&gt; 10,11. En outre, les préoccupations quant à la capacité de la méthode à stimuler directement les neurones auditifs ont été soulevées 12,20. Comme une alternative à la stimulation infrarouge, nous employons optogénétique rendre Sgns sensible à la lumière. Optogenetics est une nouvelle approche qui combine les techniques génétiques et optiques non-invasive et de contrôler spécifiquement les cellules avec une grande précision temporelle (Avis 21 au 23). La modalité actuellement la plus fréquemment utilisée emploie l&#39;expression microbienne de la 2 channelrhodopsin (CHR2) gène de Chlamydomonas reinhardtii et des variantes de ceux-ci, codant pour un canal de cation déclenché par la lumière 24. CHR2 est une protéine à 7 domaines transmembranaires en hélice qui, lorsque transduit dans des neurones et activée par la lumière bleue, agit en tant que canal cationique non sélectif, dépolarisant ainsi les cellules 24 27. ChR2 a été bien caractérisé 24,28- 31 et de nombreuses variantes ont été développées pour modifier l&#39;action spectre, déclenchement et de perméabilité 32,33. Le but de notre travail est d&#39;établir optogénétique cochléaire pour l&#39;activation de la voie auditive. Nous notons que l&#39;approche optogenetic pour stimuler le nerf auditif nécessite une manipulation génétique du ganglion spiral pour l&#39;expression de channelrhodopsin. Utilisation de la souris et le rat permet l&#39;utilisation d&#39;animaux transgéniques 13,34,35 disponibles, qui fournissent l&#39;expression d&#39;channelrhodopsin avec peu de variabilité le long de l&#39;axe et à travers tonotopique 36 animaux. La combinaison des allèles conditionnels 37 avec Cre-lignes appropriées permet l&#39;expression spécifique des cellules. Le transfert de gènes dans le ganglion spiral d&#39;autres animaux nécessite l&#39;utilisation de virus tels que le virus adéno-associé qui est une approche standard dans optogénétique 38 et que nous avons montré de bons résultats chez la souris 36. La manipulation génétique et l&#39;expression de transgènes codant pour des protéines étrangères risques baissiers pour les effets indésirables tels que la vacnir des réponses et / ou la prolifération, la situation compromise, voire la mort de cellules génétiquement manipulées. Pour les besoins de la démonstration, nous utilisons des souris transgéniques exprimant CHR2 dans les neurones du ganglion spiral dans le cadre du promoteur Thy-1 de 13 à stimuler optiquement la voie auditive. Nous notons que d&#39;autres variantes de channelrhodopsin peuvent être utilisés pour le même but que nous avons démontré en utilisant le transfert de virus médiation de la variante Catch 14 en Sgns 39. Alors que l&#39;optogénétique cochléaire nécessite une manipulation génétique, il offre tuning moléculaire pour optimiser la stimulation SGN et promesses améliorée fréquence et la résolution d&#39;intensité par rapport à une stimulation électrique. Stimulation optogenetic de la voie auditive est très pertinente pour la recherche d&#39;audition. Par exemple, il promet des avancées dans les études sur le raffinement dépendant de l&#39;activité de tonotopie pendant le développement, dans l&#39;analyse de l&#39;exigence d&#39;intégration spectrale dans son localization et de l&#39;étendue de l&#39;interaction entre les projections afférentes fréquence spécifique dans le système auditif central.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U2500-100G</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl</td>
			<td>RXV</td>
			<td></td>
			<td>Sedative and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td></td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Only to be used to hold soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>To open the skin and help with the muscle dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lempert Rongeurs&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>They are very useful to easily remove the bone from the bulla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473-nm laser&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>MLL-III473</td>
			<td>100 mW solid state 473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser driver&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>DPSSL MLL 100 mW</td>
			<td>TTL operated laser driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;m optical fiber</td>
			<td>Any comercial ; e.g. Thorlabs</td>
			<td>M42L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>PCAOM VIS</td>
			<td>Control the amount of light coupled into the fiber from the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>160T1-8SAR-24-0.8</td>
			<td>Control the acousto-optic modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo2 laser power &#38; energy meter</td>
			<td>Gentec-EO</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue &#181;LED</td>
			<td>Cree</td>
			<td>C470UT200</td>
			<td>It is necessary to build several &#956;LED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT System&#160;</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RZ6-A-P1</td>
			<td>It can be used any system for stimulus generation&#160; presentation and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-shank, 16-channel silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&#160;</td>
			<td>These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill Steel Burrs</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19007-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self tapping bone screw</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19010-10</td>
			<td>Reference screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis</td>
			<td></td>
			<td>Positioning of recording probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic stimulation of the auditory nerve

Stimulation électrique directe des neurones du ganglion spiral (de Sgns) par les implants cochléaires (IC) permet ouvert compréhension de la parole dans la majorité des sujets sourds implantés 1-6. Néanmoins, le codage du son avec IC actuelles a une mauvaise fréquence et la résolution d&#39;intensité due à large propagation actuelle de chaque contact de l&#39;électrode activation d&#39;un grand nombre de Sgns long de l&#39;axe de la cochlée tonotopique 7 9. Stimulation optique est proposé comme une alternative à la stimulation électrique spatialement plus que les promesses activation de Sgns limite et, par conséquent, une meilleure résolution en fréquence du codage. Au cours des dernières années, l&#39;illumination infrarouge directe de la cochlée a été utilisée pour provoquer des réponses dans le nerf auditif 10. Néanmoins, il nécessite des énergies supérieures à la stimulation électrique 10,11 et l&#39;incertitude demeure sur le mécanisme sous-jacent 12. Ici, nous décrivons une méthode basée sur optogénétique pour stimuler Sgnsavec la lumière bleue de faible intensité, utilisant des souris transgéniques avec expression neuronale de channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 ou expression du virus médiation de la ChR2 variante Catch 14. Nous avons utilisé des diodes électroluminescentes (μLEDs) et des lasers à fibre couplé à stimuler Sgns CHR2-exprimant à travers une petite ouverture artificielle (cochléostomie) ou de la fenêtre ronde micro-lumière. Nous avons mesuré les réponses par des enregistrements du cuir chevelu de potentiels évoqués lumière (optogenetic réponse du tronc cérébral: oABR) ou par des enregistrements de microélectrodes de la voie auditive et les avons comparés avec une stimulation acoustique et électrique.

<html> Un cochléostomie optimal est essentiel et augmente la probabilité d&#39;une expérience réussie. Cela signifie que la fenêtre est régulière, petite, et il n&#39;y a pas de blessure des structures cochléaires internes. Par exemple, des saignements indique dégâts de la strie vasculaire. Un bon exemple est présenté à la figure 1B. En utilisant des souris transgéniques CHR2, CHR2 est exprimé dans les Sgns l&#39;intérieur de la cochlée <stro...

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Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Les implants cochléaires (IC) de permettre l&#39;audition par la stimulation électrique directe du nerf auditif. Cependant, la mauvaise fréquence et la résolution d&#39;intensité limite la qualité de l&#39;audience avec les IC. Nous décrivons ici la stimulation optogenetic du nerf auditif chez la souris comme une stratégie alternative pour la recherche et le développement auditif futurs IC.

Stimulation optogenetic du nerf auditif

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K vues.  University Medical Center Goettingen.  Les implants cochléaires (IC) de permettre l'audition par la stimulation électrique directe du nerf auditif. Cependant, la mauvaise fréquence et la résolution d'intensité limite la qualité de l'audience avec les IC. Nous décrivons ici la stimulation optogenetic du nerf auditif chez la souris comme une stratégie alternative pour la recherche et le développement auditif futurs IC. 

Vidéo: Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Utilisation du protocole Theta-Burst à explorer Mechasnism de la plasticité chez les individus atteints du syndrome du X fragile et autisme

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Recherche

Neurosciences

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

Le dispositif NeuroStar TMS: Mener la FDA a approuvé protocole pour le traitement de la dépression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibre optique d&#39;implantation pour la stimulation chronique optogenetic de tissu cérébral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimulation optogenetic de comportement de fuite en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualisation directe de la Dorsale murin Cochlear Nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Évaluation des systèmes neuromusculaire Fonction Utilisation percutanée électrique stimulation du nerf

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.