Ce protocole peut être utilisé et développé pour analyser comment le rayonnement ionisant affecte le recrutement de cellules tumorales, conduisant à une meilleure compréhension de la récidive du cancer. Les organoïdes mammaires sont des modèles puissants. Ils imitent les caractéristiques in vivo de base, mais ils permettent un isolement facile des variables biologiques.
L’utilisation de plaques à faible adhérence annule les défis liés au flux de travail associés aux matrices protéiques. Les patientes triple-négatives de cancer du sein éprouvent la répétition régionale locale aux taux plus élevés suivant la thérapie. L’étude de la façon dont le rayonnement influence le comportement tumoral et immunitaire des cellules mènera à des aperçus importants des mécanismes de répétition.
Javier Gomez, étudiant diplômé du laboratoire Silvera Batista, fait la démonstration de la microscopie confoccale des organoïdes. Commencez cette procédure avec l’ablation des glandes mammaires abdominales et inguinales des souris sacrifiées comme détaillé dans le protocole de texte. 45 minutes après l’irradiation des échantillons tel que décrit dans le protocole de texte, placez les glandes mammaires dans une plaque cellulaire stérile de 35 millimètres et hachettez avec des scalpels.
Hacher avec environ 40 coups jusqu’à ce que le tissu se détende et des morceaux sont obtenus qui ne sont pas plus grands qu’environ un millimètre carré dans la zone. Maintenant, transférez le tissu à la solution de collagène dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Utilisez 10 millilitres de solution de collagène par souris.
Placez les tubes d’échantillon dans un bain d’eau pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius, en tourbillonnant pendant cinq secondes toutes les 10 minutes. La digestion est complète lorsque la solution de collagène est trouble. Faites tourner la solution digérée à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.
Maintenant, trois couches sont observées. Le supernatant est composé de graisse, la couche moyenne est une solution aqueuse, et le fond est une pastille. La pastille apparaît rouge, car il s’agit d’un mélange de cellules épithéliales, de cellules stromales individuelles et de globules rouges.
Pré-enrober toutes les pipettes, les pointes de pipette et les tubes de centrifugeuse avec la solution BSA avant le contact par ajout et retrait de la solution BSA. La solution BSA peut être réutilisée, bien qu’elle soit filtrée stérilement avant chaque expérience. Pour une récupération supplémentaire, transférez le supernatant dans un tube frais de 15 millilitres recouvert de BSA.
Pipette de haut en bas vigoureusement pour disperser la couche de graisse. Centrifuger l’échantillon à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant, en laissant une petite quantité de médias dans le tube pour éviter d’aspirer la pastille cellulaire.
Aspirez maintenant la couche aqueuse du tube avec la pastille d’origine. Ajouter 10 millilitres de DMEM/F12 au tube avec la pastille d’origine, et transférer au deuxième tube. Pipette vigoureusement pour combiner et résuspendre les deux granulés.
Après avoir centrifugé à 450 fois-G pendant 10 minutes à température ambiante, aspirer le supernatant et ajouter quatre millilitres de DMEM/F12 au tube. Ajouter 40 microlitres de désoxyribonuclease à la suspension et serrer doucement à la main pendant deux à cinq minutes à température ambiante. Ajouter six millilitres de DMEM/F12 et bien pipette.
Après avoir centrifugé le tube à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante, aspirez le supernatant à la marque de 0,5 millilitre. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de DMEM/F12 et pipette à fond. Maintenant centrifuger le tube en pulsant à 450 fois-G et en s’arrêtant quatre secondes après avoir atteint cette vitesse.
Répétez les étapes de lavage trois fois de plus pour purifier les organoïdes par différenciation centrifuge. La pastille doit maintenant être une couleur blanc clair composée uniquement d’organoïdes épithéliales. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de DMEM/F12.
Pipette à fond pour créer une solution homogène. Transférer 50 microlitres dans une boîte de Petri de 30 millimètres et la voir sous un microscope à contraste de phase à 20X. Comptez le nombre d’organoïdes avec un compteur de décompte.
Pipette 50 microlitres d’organoïdes dans chaque puits d’une plaque à faible adhérence. Ajouter 150 microlitres de milieu organoïde pour porter le volume de travail total à 200 microlitres. Remplacez soigneusement le milieu tous les deux jours.
Maintenir les macrophages crus GFP ou D-tomato-labeled 264.7 dans les médias de DMEM complétés avec 10%FPS et 1%penicilline-streptomycine. Ensemencer les cellules dans le milieu organoïde à la densité désirée. Utilisez le contraste de phase cellulaire vivante et l’imagerie fluorescente pour surveiller l’infiltration des macrophages au fil du temps.
Retirer le milieu organoïde des puits en aspirant soigneusement. Fixer les échantillons avec de la formaline tamponnée à 10 % pendant 15 minutes à température ambiante. Laver les organoïdes fixes trois fois pendant cinq minutes en 1X PBS.
Si désiré, des échantillons fixes peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant une semaine pour d’autres taches. Après le lavage, perméabiliser les organoïdes fixes pendant cinq minutes. Bloquer les organoïdes fixes avec 5% de sérum de chèvre normal dans 0,1%PBST pendant une heure à température ambiante avant de laver trois fois pendant cinq minutes avec PBS.
Incuber les organoïdes fixes avec de l’anti-cytokératine-14, de l’É-cadhérine ou de la protéine à jonction serrée, en 1% NGS en PBST pendant une heure à température ambiante. Puis laver trois fois pendant cinq minutes en PBST. Maintenant, incuber les organoïdes avec des anticorps secondaires anti-lapin de chèvre avec 1%NGS PBST pendant une heure à température ambiante.
Couvrir de papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Après le lavage comme avant, utiliser le colorant nucléaire pour tacher les noyaux pendant environ une demi-heure. Laver les organoïdes tachés pendant cinq minutes en PBS trois fois.
Si vous utilisez une glissière de chambre, montez avec un bordereau de couverture. Conserver les organoïdes enveloppés dans du papier d’aluminium à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines. Les organoïdes irradiés pourraient être cultivés dans des plaques à faible adhérence, ou dans la membrane du sous-sol, mais la croissance la plus rapide s’est produite dans les plaques à faible adhérence.
Organoïdes récapitulés caractéristiques de la glande mammaire. Des constructions morphologiquement semblables aux conduits et lobes ont été observées. Les tendances de croissance ont indiqué que lorsque les organoïdes ont été immédiatement ensemencés après digestion et tri, les organoïdes non irradiés ont augmenté plus rapidement que les organoïdes irradiés, probablement en raison de l’arrêt de la croissance cellulaire résultant de mécanismes de réparation des dommages à l’ADN.
Les organoïdes ont exprimé des caractéristiques épithéliales, qui ont été évaluées par coloration immunofluorescente. Les organoïdes irradiés ont exprimé des marqueurs épithéliales. La cytokératine-14, un marqueur du myoepithelium, a été fortement exprimée à la surface des organoïdes irradiés.
En outre, l’E-cadhérine et la protéine à jonction serrée ont été exprimées dans les jonctions cellulaires des organoïdes. Ces protéines sont essentielles pour une adhérence cellulaire appropriée. Après irradiation, les organoïdes ont continué à conserver leurs caractéristiques épithéliales.
La coloration fluorescente des organoïdes pourrait être visualisée dans les plaques à faible adhérence à l’aide de microscopie par fluorescence. Cependant, la visualisation la plus claire a été obtenue par microscopie confoccale. L’intensité totale corrigée de fluorescence a été calculée en soustrayant l’arrière-plan, et en normalisant par zone organoïde.
La culture d’organoïdes dans les plaques de co-culture de 96 puits à faible adhérence a également simplifié les expériences de co-culture. Une fois ensemencée à des concentrations typiques dans la glande mammaire, la colocalisation de macrophage a augmenté avec les organoïdes irradiés. Lors de l’exécution de cette procédure, les choses les plus importantes à retenir sont de ne pas trop digérer les organoïdes, et de purifier adéquatement la différenciation centrifuge.
Suite à cette procédure, d’autres expériences de co-culture peuvent être réalisées. Les organoïdes peuvent être co-cultivés avec des cellules tumorales, d’autres cellules immunitaires et des cellules stromales pour recréer le microenvironnement irradié associé à la récidive. Cette méthode sera importante pour évaluer comment les dommages normaux de tissu influencent spécifiquement la dynamique de cellules immunisées, et seront par la suite employées pour comprendre des mécanismes de recrutement de cellules de tumeur.
Organoïdes mammaires ont élucidé les mécanismes du développement de la glande mammaire, et ont solidement récapitulé le cancer du sein in vitro. Nous espérons que notre modèle fournit des aperçus sur le recrutement de cellules tumorales induites par la radiation.
