La synthèse des protéines est sujette aux erreurs. Cependant, les erreurs peuvent être adaptatives sous le stress physiologique. Nous avons déjà montré que des erreurs de traduction spécifiques dans la mycobactérie sont contribuées à la tolérance aux antibiotiques.
Être capable de mesurer des taux d’erreur spécifiques nous permet de cibler ce mécanisme d’adaptation aux bactéries. Les principaux avantages de ces techniques sont le gain de fonction des journalistes peuvent être extrêmement sensibles dans la mesure des faibles taux d’erreur qui ne sont pas faciles à détecter par spectrométrie de masse. L’analyse Nluc/GFP permet le criblage à débit moyen puisqu’il évite la manipulation excessive et la lyse des bactéries.
Yue-Meng Chen, doctorante, démontrera la procédure. Aujourd’hui, nous allons démontrer la procédure d’utilisation de ces deux journalistes à travers cette vidéo. Pour commencer, inoculer deux millilitres de milieu 7H9 avec des souches de reporter mycobactérien de type sauvage et mutées.
Agiter à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours ou jusqu’à ce que l’OD à 600 nanomètres atteigne la phase stationnaire. Aliquot et diluer pour obtenir un OD à 600 nanomètres autour de 0,5 à 1. Ajouter ensuite l’ATC à une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre.
Ajoutez immédiatement différentes doses de ksg à la culture selon le manuscrit pour mesurer ses effets sur les taux de mauvaise traduction. Incuber à 37 degrés Celsius en secouant pendant quatre à six heures. Ensuite, transférez les cultures bactériennes dans un tube de deux millilitres.
Et centrifugeuse à 3220 fois g à température ambiante pendant cinq minutes pour pelleter les bactéries. Après l’étape de centrifugation, jetez le supernatant et perturbez les bactéries en ajoutant 40 microlitres de tampon de lyse passive 1x. Transférer le lysate bactérien résuspendé dans une plaque blanche de 96 puits, un puits par échantillon, et secouer à température ambiante pendant 20 minutes.
Ajouter 80 microlitres de substrat de luge de feu à chaque puits. Agiter pendant 15 secondes et mesurer la luminescence par un luminomètre. Ajouter ensuite 80 microlitres de substrat Renilla à chaque puits.
Agiter pendant 15 secondes et mesurer la luminescence par le luminomètre. Utilisez les valeurs corrigées pour calculer les taux de mauvaise traduction de chaque condition. Pour commencer, inoculer deux millilitres de milieu 7H9 avec la souche bactérienne reporter.
Agiter à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours ou jusqu’à ce que l’OD à 600 nanomètres atteigne la phase stationnaire. Ensuite, la sous-culture en 50 millilitres de 7H9 moyenne et de croître jusqu’à ce que l’OD à 600 nanomètres atteint la phase stationnaire tardive. Avant d’aliquoting les bactéries à une plaque de 96 puits, ajouter l’ATC à une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre et bien mélanger.
Ajouter 100 microlitres par puits à une plaque claire à fond rond de 96 puits. Ensuite, ajoutez différentes doses de ksg à certains puits pour examiner ses effets sur les taux de mauvaise traduction. Ajouter 200 microlitres d’eau stérile aux puits de bord de la plaque pour limiter l’évaporation des puits de l’échantillon.
Sceller la plaque, secouer et induire les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures. Utilisez une pipette multicanal pour prendre 80 microlitres de chaque puits. Transférez les échantillons dans une plaque à fond noir de 96 puits et mesurez le signal GFP par le luminomètre.
Après avoir mesuré le signal GFP, centrifugez la plaque à 3 220 fois g pendant 10 minutes. Ensuite, transférez 50 microlitres du supernatant dans une plaque à fond blanc de 96 puits. Ajouter ensuite 50 microlitres de substrat Nluc à chaque puits.
Bien mélanger et mesurer la luminescence par le luminomètre. Enfin, déterminez le rapport Nluc/GFP en divisant la valeur corrigée de luminescence Nluc par fluorescence GFP. Dans ce travail, le système renilla firefly reporter a été utilisé pour mesurer le taux de mauvaise traduction en présence de kasugamycine dans le type sauvage et dans une souche de S.Smegmatis qui ksgA a été supprimé.
Les résultats ont montré une manière dose-dépendante claire de ksg diminuant le taux de mauvaise traduction tandis que dans la souche ksgA-suppression, ksg était moins puissant et la ligne de base du taux de mauvaise traduction était plus élevée en raison de la résistance à la modulation par kasugamycine. L’action de Kasugamycin sur la mauvaise traduction a également été mesurée à l’aide du journaliste Nluc/GFP. Renilla Firefly et Nluc/GFP reporter impliquent de mesurer l’activité luciferase.
Les petites erreurs de pipetage peuvent causer de grandes fluctuations dans les lectures. Pour commencer, nous suggérons d’augmenter le nombre de chaque réplique afin de minimiser les chances d’obtenir des lectures peu fiables.
