Le Wellcome Trust a fourni un soutien financier (Prix VIP pour JSY et 074 128 bourses de recherche au KLB). Conseil de recherches médicales bourse d&#39;études au RJA Leica_SP2_Stacker, un algorithme utilisé pour importer TIFF pour «reconstruction» dans une série, est basé sur Leica_tiff_sequence, un plugin pour lire Leica TIFF SP2 dans ImageJ, développé par Tony Collins et utilisé avec sa permission. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg et TurboReg, les algorithmes utilisés pour corriger les mouvements des tissus, sont basées sur Th venaz et ses collègues (1998) 9. Excel_writer.jar a été écrit par Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, l&#39;algorithme de détection des particules, est basé sur un algorithme écrit par Brain KL et détaillés précédemment 5.

Partie 1: Préparation de l&#39;indicateur de Ca 2 + (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1 est livré dans les AM 500 flacons ul comme une petite quantité (50 g) de poudre. Ajouter 40 ul Pluronic F-127 solution à la poudre, en agitant doucement pendant 30 s, puis ajouter 460 ul PSS, et agiter doucement pendant 30 s. La solution finale, 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-une heures, fournit 4 x 125 aliquotes. Eviter l&#39;exposition à la lumière et conserver à -20 ° C. </li></ol> Partie 2: Ca 2 + de chargement <ol><li> Retirer l&#39;indicateur de Ca 2 + (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) du congélateur (-20 ° C) et laisser décongeler à température ambiante. </li><li> Prélever 1 ml de PSS dans une éprouvette et placer dans un bain-marie. Bubble avec 95% 2 / 5% CO 2 à un taux d&#39;environ 1 bulle apparaissant par seconde O. Le bulleur doit être garanti dans le tube à essai, par exemple avec un bouchon ou avec du parafilm. </li><li> Disséquer les tissus de l&#39;animal et, dans un plat Sylgard bordées de Petri, retirez soigneusement le tissu conjonctif. Indépendamment du type de muscle lisse d&#39;orgue, PSS doit être remplacée toutes les 10 minutes et les tissus doivent être bien lavés (par exemple en remplaçant les trois PSS fois) la dissection suivante. Pour le canal déférent: envisager de couper l&#39;organe longueur des façons de produire une feuille de tissu. Pour la vessie: ouvert longitudinalement du col de la vessie (postérieure) au sommet de la coupole (antérieure). Préparez quatre bandes, 6 - 8 mm de long et 1 - 2 mm de large, le long de la surface dorsale du détrusor, la coupe dans le sens des faisceaux musculaires dominante. </li><li> Placer le tissu disséqué dans le «pré-chauffée et buller&quot; PSS. </li><li> Ajouter 125 ul de 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 h à l&#39;éprouvette et de donner une petite secousse, à la main, à se mélanger. </li><li> Reprendre bouillonnant et des congés, recouverts d&#39;une feuille. Le temps est nécessaire pour un tissu suffisante pour relever le Ca 2 + indicateur varie avec la taille du tissu et de l&#39;épaisseur de la couche musculaire lisse. Par exemple: 70 minutes (souris détrusor, anococcygeus rat) à 120 minutes (détrusor chez le rat, la souris vas déférent). </li></ol> Partie 3: Préparation du &quot;Ca 2 + chargés &#39;de tissus pour la microscopie Attention épinglant des tissus est nécessaire afin de minimiser le mouvement spontané des tissus (une propriété de l&#39;imagerie des cellules musculaires lisses du tissu relativement intacte) et de faciliter la localisation d&#39;un site approprié pour l&#39;imagerie (comme un morceau plat de tissu peut être interrogés en deux dimensions, plutôt que trois). <ol><li> Rincez le tissu dans PSS buller pendant au moins 5 minutes. </li><li> Mont préparation dans un plat Sylgard-alignés, étirement des tissus (un peu) pour former une feuille plate. Évitez d&#39;utiliser des longues &quot;broches&quot; qui peuvent rayer l&#39;objectif, utiliser des longueurs courtes au lieu de 25-50 um de diamètre du fil d&#39;argent comme «broches» et d&#39;insérer à un angle. </li><li> Placez le plat de préparation sur la platine du microscope, en prenant soin de s&#39;assurer que le PSS ne s&#39;échappe pas de la zone de Sylgard-alignés de l&#39;antenne (comme cela peut conduire à une grande surface étant couverte de PSS, lorsque la surfusion commence). </li><li> Mettez la pompe en vue de la préparation avec superfuse PSS. Un taux de 100 ml par heure est souvent employé. </li><li> Allumez l&#39;unité de chauffage. </li><li> Placer les tubes entrées et de sorties et de la sonde de température sur le plat de préparation (apposition chacun à la bande de métal par l&#39;aimant sur sa base). La hauteur de la pointe du tube d&#39;écoulement va déterminer la profondeur de la PSS. Soyez attentif à ce que la sortie est en fait enlever PSS (comme il le fait parfois pas initialement). </li><li> Réglez la température sur l&#39;unité de chauffage pour atteindre la température désirée, par exemple de 33 à 35 C. </li><li> Autoriser le tissu à s&#39;équilibrer pendant au moins 10 minutes. </li></ol> Partie 4: Choix du site à l&#39;image L&#39;exposition à l&#39;éclairage d&#39;excitation sera photobleach l&#39;indicateur, afin d&#39;éviter en utilisant plus de quelques secondes à la fois. <ol><li> Avec un objectif de faible puissance (10x ou 20x) utilisent épifluorescence, excitant avec une lumière bleue, pour voir les muscles lisses et d&#39;identifier une région appropriée pour surveiller. Essayez de choisir un site basé sur: le mouvement (qui devrait être minime) et le nombre de cellules musculaires lisses dans le domaine. «Structures» lumineux peuvent provoquer un nombre élevé de «faux positifs» dans l&#39;algorithme de détection d&#39;images, afin d&#39;éviter les sites avec un grand nombre de (ex) entrecoupées cellules épithéliales ou des fibroblastes. </li><li> Basculer vers un objectif de puissance plus élevée (40x). </li><li> Tourner la scène ou de l&#39;axe optique afin de la cellule musculaire lisse (s) se trouve horizontale (c&#39;est à dire parallèle à l&#39;axe de balayage rapide). </li></ol> Partie 5: La microscopie confocale Les détails de la façon dont le microscope confocal est &quot;mis en place» sont spécifiques à chaque type de microscope, maisles principales considérations sont les suivantes: vitesse (minimum de 5 Hz est requis pour la plupart de Ca 2 + transitoires), la résolution et la taille du terrain (qui sont tous deux négociés-off avec la vitesse). Certains le protocole suivant est spécifique à un Leica SP2 microscope confocal debout. Un protocole typique est le suivant: série 100 châssis, acquise à 5 Hz (256 x 256 pixels; environ 100 x 100 um.) Ou 13,5 Hz (256 x 64 pixels; environ 100 x 25 um.). La tête de balayage mis à déplacer bi-directionnelle (pour maximiser la vitesse d&#39;acquisition) et d&#39;acquérir à 1000 Hz par ligne. <ol><li> Fermer le sténopé à un «disque d&#39;Airy. </li><li> Réglez le laser (488 nm) de puissance entre 25 et 35% sur la AOTF; cette valeur est un compromis entre luminosité et photoblanchiment. (Ce dernier étant un problème particulier lors de longs enregistrements.) </li><li> L&#39;acquisition de six séries par site, et de quatre à six sites par «traitement». Il est commun de viser à surveiller les six mêmes sites pré-drogue («contrôle» par exemple) et post-drogue, bien photoblanchiment importantes peut causer l&#39;expérimentateur de s&#39;écarter de cette. </li><li> Il est essentiel de Ca 2 + imagerie que «les contrôles de temps&quot; sont effectuées. </li></ol> Partie 6: Préparation pour l&#39;analyse <ol><li> Téléchargez et installez Image J à partir de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Télécharger la version spécifique à la plateforme, puis mise à jour de la dernière version en téléchargeant le dernier fichier à partir imageJ.jar http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, remplacer l&#39;ancien fichier. Utilisateurs d&#39;Apple Mac: si elle tourne lentement, assurez-vous d&#39;utiliser la dernière version de la machine virtuelle Java (JVM) disponibles auprès d&#39;Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Télécharger Excel_writer.jar à partir de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html et installer dans les plugins [répertoire] répertoire jar&gt;. </li><li> Copiez les fichiers suivants dans le répertoire plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installez chacun de ces scripts en utilisant les plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Installer ... en fonction de ImageJ. </li><li> Nous utilisons un Leica SP2 microscope confocal, le logiciel (Leica LCS) pour ce qui génère chaque série comme un seul visible «film» dans le logiciel, mais enregistre en tant que cadres individuels. Pour reconstituer les cadres en série: (i) Assurez-vous que tous les «cadres» pour être reconstruits sont dans un seul dossier (par exemple «DataFolder&gt; Tiffs &#39;). (Ii) Sélectionnez Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Leica_SP2_Stacker. Sélectionnez le répertoire racine (par exemple «DataFolder &#39;). Sélectionnez le dossier désiré dans la liste déroulante (&#39;Tiffs /&#39; par exemple). Sélectionnez un répertoire de sortie ou de générer un nouveau («DataFolder&gt; Stacks», par exemple). Le script va ensuite reconstruire la série d&#39;images individuelles. </li></ol> Partie 7: Correction pour le mouvement Bien que le mouvement du site imagées peuvent être minimisés par une bonne épinglage et tissus uniformément tendu, certains organes des muscles lisses présentent des contractions spontanées qui ne peuvent être abolis par une surveillance attentive épinglant seul. Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un algorithme librement disponible qui aligne les cadres ou des allumettes dans une série. <ol><li> Télécharger &#39;StackReg »(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) et« TurboReg »(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installez chaque dans le répertoire plugins en utilisant les plugins&gt; Macros&gt; Installer ... </li><li> Chargez une pile à traiter (Fichier&gt; Ouvrir ...) et ensuite passer à un cadre qui montre clairement le champ d&#39;intérêt. Les autres images seront alignées à ce cadre de référence. </li><li> Plugins&gt; Piles&gt; StackReg. Essayez chacune des différentes «transformations» (Traduction c&#39;est-à-corps rigide, Rotation Scaled, Affine) afin de déterminer quelle est la plus efficace. (Plus de détails: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Partie 8: algorithme de détection de particules Pour chaque «site» imagées, les facteurs qui affectent varier la détection de Ca 2 + transitoires. En mesurant certaines propriétés de chaque site («paramètres des particules - détaillées ci-dessous), le processus de détection est facilitée. Ainsi, pour chaque site, on calcule «seuil pour soustraire», «le seuil pour le ratio&quot; et &quot;seuil de bord de cellule». <ol><li> Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Installer ... et sélectionner &#39;JNCT0.08Release.ijm ». </li><li> Plugins [Menu]&gt; Macros pile de charge&gt; (raccourci: l). Sélectionnez une série de paramètres et de calculer des particules: <ol style="list-style:none;"><li> a. Seuil pour soustraire (fond =) </li></ol></li><li> Sélectionner un ROI rectangulaire sur ce que vous croyez être «de fond». </li><li> Mesure (raccourci: M). Notez MOYENNE. <ol style="list-style:none;"><li> b. Calcul du seuil pour le ratio </li></ol></li><li> Sélectionnez une forme rectangulaireROI autour d&#39;une zone optiquement plane de la cellule (s). </li><li> Mesure (raccourci: M). Remarque ÉCART bas moyenne et standard. </li><li> Répéter encore deux fois ou vous pouvez dessiner trois boîtes à la fois en appuyant sur &#39;shift&#39;. </li><li> Calculez et notez le seuil pour le ratio = (1 + SD / moyenne) x 32, avec une moyenne des valeurs de la trois répétitions / sites. <ol style="list-style:none"><li> C. Seuil de bord cellulaire </li></ol></li><li> Image&gt; Stacks&gt; Z projet ... Choisissez le type de projection: «intensité moyenne&quot; </li><li> Image&gt; Réglages&gt; Seuil. </li><li> Sélectionnez noir et blanc. </li><li> Définir &#39;sous&#39; (curseur supérieur) limiter et noter la valeur correspondante (à droite du curseur). Seuls les événements survenant dans les régions noires seront comptés. </li><li> Cliquez sur &#39;reset&#39;. </li><li> Analyser les piles (raccourci: 2) </li><li> Sélectionnez simplement une série à ce stade, à savoir le «premier fichier» et «le dernier fichier&quot; devrait être le même. </li><li> Entrez les valeurs de «seuil de soustraire», «le seuil pour le ratio&quot; et &quot;seuil de bord de cellule». Laissez les autres paramètres à leurs valeurs par défaut. </li><li> L&#39;algorithme va produire une fenêtre à double volet, dans lequel la série traitée est indiqué sur la gauche et l&#39;original sur la droite. Soigneusement passer par ce afin d&#39;évaluer le nombre de faux positifs et les occasions où les événements, visibles à l&#39;œil, n&#39;ont pas été détectés. Pour obtenir une détection plus précise de Ca 2 + transitoires, il peut être nécessaire d&#39;ajuster légèrement certains des &#39;paramètres des particules ». Bien que le processus peut sembler un peu «à l&#39;aveuglette» sur la première tentative, on obtient rapidement une sensation de ce que les paramètres sont essentiels. </li><li> Pour chaque série, l&#39;algorithme génère un fichier Excel que les caractéristiques des détails sur l&#39;événement détecté (comme l&#39;amplitude, la superficie et position). «Faux positifs» - identifié en examinant les fichiers image que les sorties algorithme (par exemple 8,17 étape) - peuvent être retirés, à la main, à partir de ce fichier Excel. </li></ol>

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	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Des efforts ont été faits pour minimiser le nombre d&#39;animaux utilisés et de leurs souffrances, toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les animaux au Royaume-Uni (Scientific Procedures) Act 1986 et la directive du Conseil des Communautés européennes 86/09/EEC.

Choix de fluorescence de Ca 2 + indicateur de Oregon Green 488 BAPTA-1 AM a été choisi comme le Ca 2 + indicateur parce qu&#39;il (i) est lumineux par rapport à d&#39;autres indicateurs (par exemple, Fluo-4 et Green calcium) 1, (ii) est sensible à des changements physiologiques dans concentration de Ca2 + avec un Kd d&#39;une ampleur similaire à l&#39;une intracellulaire de Ca 2 + concentration [Ca 2 +] i (par exemple des canaux déférents 2), (iii) les charges de nombreuses cellules musculaires lisses, cellules musculaires lisses permettant couplage à être surveillés. Toutefois, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM est un non-ratioable Ca 2 + indicateur, et en tant que tels ne peuvent pas facilement être utilisés pour déterminer l&#39;absolu [Ca 2 +] i. Par ailleurs, il peut également tampon de Ca 2 + s&#39;ils sont présents à des concentrations élevées et devient saturé avec des changements de grande amplitude dans [Ca 2 +] i. L&#39;inhibition de la contractilité spontanée La contractilité spontanée des organes musculaires lisses peut être réduite pharmacologiquement, par exemple en bloquant le déplacement de Ca 2 + par le biais de type L canaux Ca 2 + (par exemple: la nifédipine 3; diltiazem 4). Notez que ces médicaments permettra de réduire considérablement l&#39;amplitude de la cellule entière de Ca 2 + flashs / transitoires. La contraction du canal déférent résulte d&#39;une combinaison de la neurotransmission surtout purinergiques et noradrénergiques. Focale de Ca 2 + transitoires dans ce tissu sont, cependant, insensible aux blocage des récepteurs noradrénergiques (par exemple α 1 adrénergiques, par la prazosine 5) afin circulation peut être réduit sans affecter focale Ca 2 + transitoires. Alternativement, la contraction peut être empêché «en aval» par l&#39;inhibition de la lumière par exemple la chaîne de myosine kinase par wortmannine 6. Conclusions Surveillance de Ca 2 + de fluorescence à résolution submicronique est une technique puissante pour étudier les effets de post-jonctionnelle libération des neurotransmetteurs 5,7 et la libération de Ca 2 + dans les magasins internes (par exemple «étincelles» 8). L&#39;analyse de Ca 2 + transitoires en utilisant la méthodologie décrite ici est rentable par rapport aux paquets disponibles dans le commerce d&#39;analyse d&#39;image et permet l&#39;analyse sur-mesure grâce à des plugins Java personnalisé écrit pour ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Ca 2 + imagerie des cellules musculaires lisses permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires qui peuvent ne pas entraîner des modifications du potentiel de membrane, comme la libération de Ca 2 + dans les magasins internes, et permet de multiples cellules d&#39;être surveillés simultanément afin d&#39;évaluer, par exemple, de couplage en tissus syncytial. Subcellulaire Ca 2 + transitoires sont fréquentes dans le muscle lisse, mais sont difficiles à mesurer avec précision en raison des problèmes causés par leur occurrence stochastiques, sur un champ souvent de vue large, dans un organe qui le prédispose à se contracter. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une série de protocoles d&#39;imagerie et des routines d&#39;analyse d&#39;acquérir, puis d&#39;analyser, de façon automatisée, la fréquence, la localisation et l&#39;amplitude de ces événements. Bien que cette approche peut être appliquée dans d&#39;autres contextes, notre propre travail implique la détection des locaux purinergiques Ca 2 + transitoires pour localiser la libération du transmetteur avec une résolution inférieure au micron. ATP est libéré comme un cotransmitter de nerfs autonomes, où il se lie à des récepteurs P2X1 sur le muscle lisse du détrusor et le canal déférent. Ca 2 + entre dans le muscle lisse, résultant en purinergiques neuroeffecteurs Ca 2 + transitoires (NSTI). La focale de Ca 2 + transitoires permettent le suivi optique de la libération du neurotransmetteur d&#39;une manière qui a de nombreux avantages sur l&#39;électrophysiologie. En dehors de la résolution spatiale améliorée grandement, enregistrement optique a l&#39;avantage supplémentaire de permettre l&#39;enregistrement de la libération du transmetteur de nombreux sites distincts simultanément. Par ailleurs, le plan optique de focalisation est plus facile de maintenir ou de corriger lors de la série enregistrement long que ce qui est le repositionnement d&#39;une microélectrode intracellulaire forte. En résumé, une méthode pour l&#39;imagerie de Ca 2 + fluorescence est décrite qui détaille la préparation des tissus, et l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données. Nous décrivons l&#39;utilisation de plusieurs scripts pour l&#39;analyse de ces Ca 2 + transitoires.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Détails des méthodes à haute résolution Ca<sup&gt; 2 +</supImagerie&gt; des muscles lisses au sein des organes isolés, notamment: la préparation des tissus, d&#39;acquisition d&#39;images et l&#39;analyse des données.

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.2K vues.  University of Oxford. Détails des méthodes à haute résolution Ca 2 + des muscles lisses au sein des organes isolés, notamment: la préparation des tissus, d'acquisition d'images et l'analyse des données.

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Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

L&#39;isolement de l&#39;homme de l&#39;artère ombilicale cellules musculaires lisses (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Recherche

Biologie

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolement de l&#39;artère pulmonaire cellules musculaires lisses de souris néonatales

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Blessure à la gorge aortique murine: une efficacité<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de prolifération des cellules musculaires lisses et fonction endothéliale

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Mesurer la prolifération des cellules musculaires vasculaires lisses à l'aide de la chimie de clic

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

Isolement des cellules musculaires lisses aortiques primaires spécifiques au patient et mesures semi-quantitatives de contraction en temps réel in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...