Ce protocole est approprié pour étudier d’où proviennent les protéines présynaptiques : corps cellulaires ou axones. Et comment les protéines présynaptiques s’accumulent dans les présynapses d’une manière organisée pendant la formation de synapse. Cette technique peut induire des milliers de présynapses en même temps, et n’utilise aucun appareil spécial pour maintenir les axones dans la culture permettant une analyse efficace de la formation de nombreuses présynapses dans les axones.
Avec l’étudiant diplômé, Honami, démontrant cette procédure sera Rie Ishii, un étudiant de premier cycle dans mon laboratoire. Commencez cette procédure par l’euthanasie de souris telle que décrite dans le protocole de texte. Disséquer l’abdomen pour obtenir des embryons E16.
Retirez soigneusement le cerveau des embryons à l’aide de forceps à pointe fine et transférez-les dans des plats de culture cellulaire de 60 millimètres contenant quatre millilitres de solution de sel tamponnée HEPES ou HBSS. Retirer les méninges et couper l’ampoule olfactive. Séparez les cortices de chaque hémisphère cérébral à l’aide des extrémités fines des forceps sous le microscope stéréo et transférez-les dans un autre plat de 60 millimètres contenant du HBSS frais.
Utilisez au moins trois à cinq embryons pour chaque culture distincte de boule de neurone. Couper les cortices en petits morceaux avec des ciseaux à ressort microdissecting dans une hotte de culture cellulaire à écoulement laminaire. Maintenant, transférez des cortices hachés dans un tube de 15 millilitres.
Essayez de trypsiniser les cortices hachés en quatre millilitres de trypsine de 0,125% dans HBSS pendant 4,5 minutes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Transférer les agrégats cellulaires dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS par une pipette de transfert stérile. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de répéter cette étape une fois de plus.
Ensuite, transférez les agrégats cellulaires dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de NGB moyen, 0,01%DNase I, et 10% sérum cheval. Triturer les cortices trypsinized en les pipetting à plusieurs reprises de haut en bas trois à cinq fois à l’aide d’une pipette pasteur en verre fin poli par le feu. Pour la préparation des boules de neurone, ajustez la densité cellulaire dans la suspension cellulaire à un million de cellules par millilitre à l’aide du milieu NGB.
Ajouter sept millilitres de PBS à la partie inférieure des plats de culture. Culture des neurones corticals comme des gouttes suspendues de 10 microlitres contenant 10 000 cellules par goutte à l’intérieur des couvercles supérieurs des plats de culture de 10 centimètres. Gardez la vaisselle dans un incubateur pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 dans des conditions humidifiées pour permettre la formation de boule de neurone.
Enrober la poly-L-lysine ou la PLL sur le couvercle en verre perlé de paraffine glisse dans des plats de 60 millimètres à l’aide d’une solution PLL de 15 microgrammes par millilitre dans un tampon borate. Conservez-les pendant au moins une heure dans un incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius. Après avoir été lavé quatre fois avec du PBS, transférer les feuillets de couvercle recouverts de PLL dans une plaque de quatre puits contenant 350 microlitres de milieu NGB avec trois micromolaires AraC dans chaque puits.
AraC est ajouté aux médias pour tuer les cellules de division. Incuber les plaques à quatre puits contenant les glissements de couverture recouverts de PLL dans l’incubateur de CO2 pendant au moins 20 minutes pour s’assurer que la température du milieu atteint 37 degrés Celsius avant de transférer les boules de neurone. À DIV 3 lorsque les boules de neurone sont très bien formées, transférez-les sur des feuillets de couverture recouverts de PLL.
À l’intérieur de la plaque de quatre puits, ajouter cinq boules de neurone par puits. Au DIV 11 transférer 20 microlitres de la suspension des particules magnétiques enduites de streptavidine à un tube de microcentrifugeuse. Immobiliser les perles à un appareil fait main attaché avec des aimants permanents au néodymium et laver trois fois avec 100 microlitres de PBS-MCBC dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Après avoir complètement retiré PBS-MCBC des perles, ajouter un volume prédéterminé de bouillon LRRTM2 aux perles lavées. Incuber le mélange à l’aide d’un rotateur à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures. Après l’incubation, laver les perles deux fois avec 100 microlitres de PBS-MCBC.
Ensuite, laver les perles avec 100 microlitres de NGB moyen. Resuspendez les perles LRRTM2 dans 50 microlitres de milieu NGB pour application à la culture de boule de neurone. Maintenant, coupez l’extrémité d’une pointe jaune à angle de 45 degrés avec une lame de rasoir sous le microscope stéréo.
Mettez l’extrémité jaune sur la zone du corps cellulaire d’une boule de neurone et retirez les corps cellulaires par aspiration. Appliquez le LRRTM2 et contrôlez les perles sur la culture de boule de neurone. Puis submergez les perles au fond des plaques de la culture de boule de neurone pendant une minute utilisant des aimants de ferrite pour commencer la formation de pré-synapse.
Cette procédure garantit de toucher toutes les perles en même temps. Fixer et tacher les neurones dans la culture de boule de neurone après formation de pré-synapse avec des perles comme décrit dans le protocole de texte. Capturez des images différentielle de contraste d’interférence et d’immunofluorescence sous un microscope fluorescent inversé à l’aide d’une caméra CCD refroidie à l’aide d’une lentille d’immersion d’huile 60X.
Mesurer l’intensité de l’immunofluorescence dans les pré-synapses de l’axon. Utiliser des intensités d’immunofluorescence de la région d’intérêt sur les perles. Moins l’intensité de la région des perles coupées divisée par l’intensité axonale, le long de 20 microns des perles.
Moins l’intensité de fond. Cette intensité de ratio fournit l’indice d’accumulation de protéines. Pour quantifier le niveau d’accumulation d’une protéine particulière dans une présynapse induite par des perles LRRTM2, sélectionnez toujours la zone qui est deux champs de vision ou plus en dehors du corps cellulaire.
Pour une mesure précise, choisissez cinq champs axonals différents par coverslip. Montré ici est l’application de perles LRRTM2 dans la culture de boule de neurone à DIV 11 accumulation induite de Munc18-1 dans les présynapses d’axones de boules de neurone. Les perles sur les axones des boules de neurone sont visibles dans les images de microscopie de phase.
Et l’accumulation de protéines présynaptiques sont observées par les images d’immunofluorescence. Même chez les axones qui sont enlevés corps cellulaires, l’accumulation de Munc18-1 a été observée sous les perles, semblable aux axones de boules de neurone avec des corps cellulaires. Lorsque la région périphérique de la feuille axonale a été analysée par objectif de grossissement élevé, vGlut1 et Munc18-1 se sont accumulés clairement dans les présynapses d’axones sous les perles avec et sans corps cellulaires.
Les expériences de cours du temps ont démontré que l’accumulation de vGlut1 dans les présynapses a augmenté de manière significative à 30 minutes. D’autre part, munc18-1 accumulation a commencé à augmenter de façon significative à deux heures et a atteint un plateau à quatre heures. Ces données indiquent que la protéine vésicule synaptique vGlut1 s’accumule dans les présynapses plus tôt que la protéine de zone active Munc18-1.
L’accumulation de Munc18-1 dans les présynapses des neurones Fmr1-KO a augmenté 1,5 fois plus que celles de type sauvage, ce qui indique la participation du FMRP à l’accumulation de Munc18-1. L’inhibiteur de synthèse de protéine, anisomycine, a supprimé l’accumulation munc18-1 de manière significative dans les axones avec et sans corps cellulaire. Cela indique que l’accumulation dépend de la synthèse des protéines.
Pipetting les cortices trypsinized utilisant une pipette pasteur en verre fin poli par le feu est une étape importante. Les expérimentateurs préparent les pipettes polies au feu de deux à trois diamètres différents, et choisissent une pipette d’un diamètre approprié. À l’aide de cette procédure, la libération synaptique des présynapses induites par les perles LRRTM2 est mesurée par imagerie vivante.
Cette méthode supplémentaire répondrait si la synthèse des protéines dans les axones est impliquée dans la régulation de la libération synaptique. À l’aide de cette méthode, les chercheurs examinent comment les protéines présynaptiques s’accumulent en présynapses de manière organisée, ainsi que l’emplacement de la source de protéines présynaptiques.
