Le rhabdomyosarcome est une forme rare de sarcomes des tissus mous caractérisés histologiquement par la morphologie tissulaire et l’expression de marqueurs myogéniques. Cependant, étant donné l’existence de différents sous-types de ces tumeurs et l’hétérogénéité des stimuli qui contribue à sa formation, l’identification de la cellule d’origine a été très difficile. Ici, nous décrivons des méthodes reproductibles et fiables pour l’identification de la cellule d’origine des rhabdomyosarcomes à partir de tissus tumoraux fraîchement récoltés à partir de souris et cet essai est l’analyse de formation tumorsphère.
Les principaux avantages de l’essai de formation de tumorsphère est qu’il s’appuie sur des propriétés cellulaires qui sont connues pour être présentes dans les cellules tumorales et il peut également être employé pour l’expansion et l’enrichissement de la population cellulaire spécifique. En outre, sa structure sphéroïde imiter l’environnement tumoral, de ce fait, ils peuvent être utilisés comme des études de dépistage des médicaments. Cette méthode a le potentiel d’être appliquée à d’autres types de tumeurs parce qu’elle ne nécessite pas de connaissance préalable des marqueurs moléculaires, mais elle peut nécessiter l’optimisation des conditions de culture.
Tumorsphere peut prendre un certain temps à se former, surtout si vous essayez d’identifier une population de cellules rares au sein de votre tumeur. Ainsi, il n’est pas suggéré de regarder votre plaque de sous-culture tous les jours, car elle pourrait affecter négativement les résultats de vos expériences. Commencez par réchauffer une plaque de 10 centimètres avec cinq millilitres de supports d’isolement dans un incubateur à 37 degrés Celsius.
Pesez 500 à 1000 milligrammes du tissu tumoral et placez-le dans la plaque. Apportez la plaque avec le tissu tumoral à une hotte de culture stérile et hacher avec une lame de rasoir. Pour une digestion optimale, assurez-vous que les tailles des pièces hachées sont uniformes.
Transférer le tissu haché et les supports d’isolement cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Lavez la plaque avec quatre millilitres de médias et ajoutez-la au tube. Ajouter 700 unités par millilitre de solution de collagène au tube et l’incuber dans un bain d’eau secouant à 37 degrés Celsius pendant 1 1/2 heures.
Après l’incubation, faire tourner le tissu à 300 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant sans perturber la pastille, puis résusquer la pastille en 10 millilitres de deuxième solution de digestion et incuber dans le bain d’eau secouant pendant 30 minutes de plus. Après la deuxième digestion, pipette la suspension cellulaire de haut en bas et passer à travers un filtre en nylon de 70 micromètres sur un tube de centrifugeuse de 50 millilitres.
Ensuite, lavez le filtre avec 10 millilitres de supports d’isolement cellulaire et faites tourner le tissu à 300 fois g pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille en 20 millilitres de cellules tumorales. Transférer la suspension dans une plaque de culture de 15 centimètres et placer les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, changez les médias pour enlever les débris et les cellules mortes qui peuvent avoir une influence négative sur la survie des cellules. À ce stade, évaluer la confluence cellulaire et permettre aux cellules de croître dans l’incubateur jusqu’à ce qu’il atteigne 90%Surveiller les cellules tous les jours et changer le média tous les deux jours. Pour la dérivation tumorale, utilisez des cellules au passage P1 ou P2 pour éviter la sélection cellulaire par plusieurs passages.
Laver le plat cellulaire avec du PBS, puis les couvrir de solution de détachement. Placez-les dans l’incubateur pendant cinq à dix minutes, puis confirmez le détachement en regardant la plaque sous un microscope brillant. Une fois que les cellules se sont détachées, ajouter des cellules tumorales à la plaque et transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse.
Faites tourner les cellules vers le bas à 300 fois g pendant cinq minutes, enlevez le supernatant, et résuspendez les cellules dans les médias de tumorsphère. Après avoir réutilisé les cellules, comptez-les à l’aide du bleu Trypan et calculez la concentration cellulaire. Plaquez le nombre approprié de cellules dans une plaque à faible attachement de 96 puits et placez les cellules dans l’incubateur jusqu’à la fin de l’expérience, en prenant soin de ne pas déranger la plaque à moins de reconstituer les supports.
Après l’achèvement de l’expérience, identifiez les tumeurs manuellement sous un microscope à champ lumineux ou à l’aide du logiciel Celigo. Le nombre et la taille des tumorsphère peuvent être évalués à la suite de cet essai. Pour préparer des tumorspheres pour la transplantation d’allograft, rassemblez toutes les tumeurs obtenues à partir d’un type ou d’un traitement spécifique de cellules.
Centrifugez les tumeurs et retirez soigneusement le supernatant avec une pipette d’un millimètre suivie d’une pipette de 200 microlitres, puis lavez-les avec 10 millilitres de PBS stérile. Faites tourner les tumorspheres vers le bas à nouveau et aspirer le PBS. Ajouter 500 microlitres à un millilitre de solution de détachement cellulaire sur le dessus de la pastille tumorsphère et incuber les cellules dans un bain d’eau secouant à 37 degrés Celsius.
Vérifiez la progression de la digestion toutes les 10 minutes. L’ensemble du processus prend jusqu’à 30 minutes. Si la digestion de la tumorsphère dans le bain d’eau secouant n’est pas suffisante pour obtenir une solution à cellule unique, une perturbation mécanique par pipetting de haut en bas est suggérée.
Notez qu’après avoir fait tourner les tumorspheres ne forment pas une pastille stable, donc aspirer le supernatant doit être fait avec soin avec une pipette d’un millilitre et pipettes de 200 microlitres. Une fois qu’une solution à cellule unique est obtenue, ajoutez un volume de médias cellulaires tumoraux et faites-la tourner vers le bas à 300 fois g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Après cette centrifugation, toutes les étapes subséquentes doivent être effectuées sur la glace.
Resuspendez les cellules dans les cellules à tumeur froide et comptez les cellules vivantes à l’aide de l’exclusion bleue trypan. Déterminez le nombre approprié de cellules pour l’allogreffe et diluez-la en 50 microlitres de médias de cellules tumorales froides. Placez une pointe de pipette dans le média de cellules tumorales froides pour le refroidir, puis utilisez-le pour prendre 50 microlitres de solution ECM froide et l’ajouter au tube avec des cellules, en s’assurant de ne pas enlever le tube ECM de la glace au cours de ce processus.
Maintenir les cellules sur la glace jusqu’à la transplantation et placer une seringue à insuline plafonnée de 0,5 millilitre avec une aiguille de calibre 29 sur la glace. Après avoir confirmé que la souris a été correctement anesthésiée, raser le côté droit de l’animal, aspirer la solution cellulaire dans la seringue refroidie, et injecter les cellules sous-cutanée dans la zone rasée. Si l’injection est effectuée correctement, une bosse visible se formera sous la peau.
Ce protocole peut être utilisé pour former de manière fiable tumorspheres pour l’identification des populations de cellules rares qui sont responsables du développement du sarcome des tissus mous. Une partie fondamentale de cet essai est la discrimination entre les tumeurs et les amas cellulaires, qui présentent des différences morphologiques claires. Pour déterminer la concentration optimale à laquelle une protéine d’intérêt déclenche un effet sur les cellules tumorales, il est nécessaire d’évaluer le niveau d’expression des cibles en aval de la protéine.
Trois des gènes testés ont montré une réponse dose-dépendante au traitement recombinant de protéine et un n’a pas. Afin d’établir un protocole efficace, les effets de la transfection sur les cellules tumorales inhérentes ont été analysés; deux quantités différentes de réaccente ont été examinées et l’efficacité a été évaluée avec un plasmide de GFP-reporter. Des quantités plus faibles de reagent ont eu comme conséquence l’efficacité plus élevée de transfection.
Un protocole en deux étapes a dû être mis en œuvre pour effectuer la transfection sur les cellules en suspension. La transfection a été exécutée sur des cellules adhérentes et 24 heures plus tard elles ont été détachées et plaquées dans la suspension ; après sept jours, les tumeurs commandées exprimaient GFP. Après que des tumorspheres soient obtenus, traités, et transplantés il est possible de comparer l’effet de ce traitement différent dans la croissance de tumeur in vivo.
Ces méthodes permettront aux scientifiques de répondre aux questions toujours en cours de la cellule d’origine des rhabdomyosarcomes tout en jetons les bases du dépistage des drogues.
