L’établissement de ce modèle humanisé de souris peut faciliter les études précliniques sur le VIH. Par exemple, les différentes souches virales et les nouvelles interventions contre le VIH peuvent être évaluées. Ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer le statut de variante du donneur de cellules souches CCR5 et pour infecter efficacement les souris humanisées avec le VIH et pour quantifier les charges virales plasmatiques de souris.
Le protocole de quantification de l’ARN peut être facilement adapté pour quantifier n’importe quelle séquence virale d’ARN de choix qui est détectable dans les échantillons de plasma. Pour le dépistage génétique des échantillons de sang de cordon ombilical pour les variantes du delta CCR5 32, incuber 1,25 microlitres de flowthrough non granulé avec 11,25 microlitres de mélange PCR contenant 200 micromolaires dNTP mix, 0,01 unité par microlitre de polyméthère d’ADN haute fidélité, et amorces avant et inverse comme détaillé dans le tableau. Réglez le volume avec de l’eau sans nucléase à environ 12,5 microlitres pour chaque réaction PCR et amplifiez les fragments génomiques avec le programme de cycle PCR comme indiqué dans le tableau.
À la fin de la réaction, séparez les produits PCR sur un gel agarose de 2 %. Les produits PCR des allèles de type sauvage et des allèles delta 32 produisent respectivement des fragments pcr de 196 paires de base et 164 paires de base, ce qui rend les bandes facilement reconnaissables par électrophorèse gel. Pour l’exposition intravaginale au VIH, placez une lampe chauffante centrée sur le centre de l’espace de travail où la souris sera située et placez des pointes stériles de pipette de 20 microlitres dans une pipette appropriée dans le capot.
Placez un contenant contenant un désinfectant liquide dans le capot pour l’inactivation immédiate des matériaux et des liquides qui ont été en contact avec le virus. Placez la souris anesthésiée sur un tampon bleu stérile en position supinée sous la lampe avec la queue de la souris face à l’arrière du capot et confirmez l’absence de réponse au réflexe de pédale dans la souris. Saisir l’animal à la base de la queue.
Soulevant doucement la souris par la base de la queue, soutenez l’animal en position verticale à l’envers. Utilisez une pointe stérile de tuyau pour stimuler la région génitale avec caresser doucement vers le haut vers l’anus pour induire la vidus du rectum et pour soulager la pression sur le vagin. Pour exposer l’ouverture vaginale, enveloppez soigneusement la queue de souris sur les doigts, de sorte que la vulve s’ouvre naturellement.
À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, placez la pointe au niveau de l’ouverture vaginale et relâchez atraumatically 20 microlitres du virus dans le vagin, permettant à la gravité de tirer la suspension virale dans le vagin. Lorsque tout le virus a été livré, maintenez la souris dans cette position pendant cinq minutes pour éviter les fuites induites par la gravité du virus. Ensuite, retournez soigneusement la souris dans sa cage d’origine en position supine et surveillez jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement.
Pour isoler l’ARN des échantillons de plasma de souris décongelés, utilisez un kit d’isolation de l’ARN du virus selon les instructions du fabricant. Ajoutez l’échantillon qui se lie à la colonne et ajoutez une étape de traitement DNase sur la colonne pour assurer l’élimination de tout l’ADN dans l’échantillon plasmatique. Ensuite, conservez les échantillons d’ARN à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure.
Pour synthétiser l’ADNC, utilisez la transcriptase inverse selon les protocoles standard, y compris 0,5 microlitres d’un inhibiteur de la RNase dans la réaction de l’ADNC pour éviter la dégradation de l’ARN, puis effectuez la synthèse de l’ADNC telle que détaillée dans le tableau et stockez les échantillons d’ADNC à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Pour préparer des échantillons de ddPCR, mélangez 11 microlitres de mélange de réaction de sonde ddPCR contenant de la polymése et des dNTP avec 250 nanomolaires de sonde de liaison de rainure mineure et 900 nanomolaires de chacune des amorces avant et arrière, comme indiqué dans le tableau. Ajouter trois microlitres de chaque échantillon d’ADNC et ajuster les volumes totaux de PCR à 22 microlitres avec de l’eau sans nucléase.
Utilisez de l’huile de production de gouttelettes pour les sondes sur un générateur de gouttelettes selon le protocole du fabricant pour émulsionner les mélanges PCR. Exécutez ensuite le programme PCR tel qu’il est décrit dans le tableau. Pour le traitement de la multithérapie après une infection confirmée par le VIH, nourrissez les souris avec des granulés préparés par un fournisseur externe contenant un régime standard de la multithérapie, comme indiqué dans le tableau.
Utilisez un régime cART de couleur rouge pour le distinguer facilement du chow de souris ordinaire et utiliser un régime chow de contrôle sans cART dans une couleur brune standard. Pour l’initiation du traitement, placez le régime chow contenant du cART dans des cages stériles avant de transférer les souris de l’ancienne cage à la nouvelle cage. Surveillez ensuite le poids des souris et vérifiez quotidiennement la consommation de chow contenant du cART pour vous assurer que les souris s’adaptent au changement.
Ici, la stratégie de gating de cytométrie de flux pour l’analyse de la pureté de cellules souches est dépeinte, avec la pureté des cellules souches positives isolées de CD34 s’étendant typiquement entre 85 à 95%avec une contamination de cellules T inférieures à 1%. L’analyse pcr démontre le statut de variante CCR5 des cellules souches donneurs purifiées, rendant les donneurs de CCR5 delta 32 hétérozygotes facilement identifiables. La fréquence du génotype mutant dans un groupe de 19 donneurs était d’environ 15,8 %, en accord avec des études épidémiologiques plus importantes sur les populations scandinaves.
Trois à cinq mois après le transfert adoptif de 7,5 fois 10 à la 4ème cellule positive humaine CD45 chez les souris receveurs, 20 à 50% des globules blancs récupérés dans les échantillons de sang périphériques animaux receveurs sont des cellules humaines CD45 positives et les souris auront développé des cellules humaines B et T. 64 % des souris sont infectées par le VIH à la suite d’une exposition vaginale, comme on l’a démontré. Quatre semaines après le passage à un régime alimentaire de 40 jours contenant la multithérapie standard, les charges virales chez les souris séropositives diminuent en dessous de la limite de détection.
Après l’arrêt de l’alimentation, le virus rebondit, reflétant des données cliniques. Fait important, les souris sur cART tolèrent bien le changement de régime alimentaire. Il est crucial de se rappeler que ces animaux sont immunodéficients et donc vulnérables à l’environnement.
L’adhésion aux techniques aseptiques augmentera le succès global de la santé animale et du protocole. Après l’établissement de la cohorte humanisée de souris pour l’infection par le VIH, le protocole peut être adapté pour la quantification virale de l’ARN dans les tissus ou pour tester de nouvelles interventions dans différentes souches virales. La flexibilité et l’accessibilité des souris humanisées pour les études sur l’infection par le VIH ont permis des progrès critiques dans la virologie, l’immunologie et la recherche sur le traitement du VIH.
Avant d’essayer des protocoles concernant le VIH infectieux, assurez-vous d’obtenir l’approbation des responsables locaux de l’environnement de travail et de respecter les procédures de décontamination approuvées.
