Cette méthode fournit des solutions aux questions biologiques exigeantes d’aujourd’hui. À partir d’une expérience FPOP en cellule, nous pouvons étudier les interactions protéine-ligand, les sites d’interaction protéine-protéine et les régions de changement conformationnel. L’avantage de cette technologie est l’utilisation d’une plate-forme IC-FPOP automatisée à six puits à base de plaques qui permet de cultiver des cellules et d’effectuer des études FPOP en cellule directement au laser.
Cette méthode peut être utilisée dans les industries pharmaceutiques et biotechnologiques, ainsi que dans les principaux instituts de recherche universitaires et cliniques, en particulier par les chercheurs biologiques des universités qui étudient la dynamique des protéines. Pour commencer, dévissez l’incubateur de la plate-forme du stade de positionnement et déconnectez les lignes de température, de gaz et d’humidificateur. Vaporiser l’incubateur de 70% d’éthanol et le placer dans le capot de culture cellulaire.
Retirez la plaque de six puits de l’incubateur de la plate-forme, fixez le couvercle d’origine de la plaque et confirmez la confluence cellulaire à l’aide d’un microscope, puis placez la plaque de six puits avec des cellules confluentes dans l’incubateur de la plate-forme à l’intérieur du capot de culture cellulaire. Insérez trois tubes Tygon prédéprimés dans chaque puits via les ports intégrés en rinçant les tubes vers les murs du puits et fixez-les avec des anneaux imprimés 3D personnalisés. Préparez un script logiciel d’intégration pour le retrait de la pompe.
Utilisez une pompe périssaltique pour retirer complètement les médias cellulaires des six puits. Les solvants de premier choix dans chaque canal des trois autres pompes périssaltiques, puis infusent le peroxyde d’hydrogène et le tampon de désaltérant dans leurs tubes alternatifs respectifs jusqu’à ce que les reagents atteignent les ports de l’incubateur. Confirmez que le faisceau laser a été incliné correctement et atteint l’incubateur décomplexé.
Vérifiez l’énergie laser à l’aide d’un capteur externe. Préparez le script logiciel d’intégration pour l’infusion de la pompe après confirmation de l’alignement du faisceau. Infuser du peroxyde d’hydrogène de 200 millimlaires à 35 millilitres par minute dans le premier puits.
Appuyez sur le bouton de démarrage sur le logiciel laser à la marque de cinq secondes pour déclencher l’impulsion à la marque de 11 secondes sur la mise à jour. Infuser la solution Quench de 125 millimlaires à 35 millilitres par minute dans le premier puits immédiatement après l’impulsion laser. Déplacez manuellement l’étape de positionnement pour aligner le puits suivant avec le faisceau laser et répéter le processus pour tous les puits.
Dans un capot de culture cellulaire, utilisez un grattoir cellulaire pour transférer les cellules de chaque puits en tubes coniques individuels de 15 millilitres. Cellules centrifugeuses à 1200 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et résuspendez les cellules dans 100 microlitres de tampon de lyse RIPA.
Transférer les cellules vers des tubes individuels de polypropylène de 1,2 millilitre. Congelez tous les échantillons dans de l’azote liquide et placez-les dans un congélateur à moins 80 degrés jusqu’à utilisation. Pour localisér les modifications FPOP, analyser le lysate de cellules digéré à l’aide de l’analyse de spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide, puis calculer l’étendue de la modification.
Pour confirmer que les conditions de l’incubateur de plate-forme sont suffisantes pour la culture cellulaire à la plate-forme laser, GCaMP2 a été transitoirement transposé en HEK293T et l’efficacité de transfection pour les deux plaques a été évaluée par imagerie par fluorescence. Un essai de luciferase a été exécuté pour quantifier l’efficacité de transfection. Les modifications FPOP dans les cellules HEK293T étiquetées dans le système d’écoulement ont été comparées à celles étiquetées dans l’incubateur de plate-forme.
L’incubateur de plateformes a surpassé le système de flux tant dans le nombre de protéines modifiées que dans la couverture totale de FPOP dans ces protéines. Dans le système d’écoulement, deux peptides modifiés ont été détectés, fournissant des informations structurelles limitées. Cependant, cinq peptides modifiés couvrant la séquence d’actine ont été détectés dans l’incubateur de plate-forme.
Les spectres tandem ms de l’actine avec proline modifiée dans les deux systèmes et peptide d’actine non modifié sont montrés ici. Les résidus modifiés FPOP dans les échantillons de l’incubateur de la plate-forme contenaient 12 résidus modifiés, trois résidus modifiés dans le système d’écoulement et un résidu modifié qui se chevauchait. L’analyse de la SP LC-MS a révélé que 792 protéines ont été modifiées par in vivo FPOP dans l’incubateur de plate-forme par rapport aux 545 protéines modifiées avec le système d’écoulement.
Il est impératif de maintenir les cellules dans des conditions stériles. Apportez toujours l’incubateur de plate-forme dans le capot stérile de culture cellulaire pour insérer toutes les plaques, tubes et anneaux nécessaires de six puits. Cela garantit l’intégrité de l’expérience.
