Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les effets thérapeutiques du NIR-PIT sur les tumeurs thoraciques dans un modèle tumoral cliniquement pertinent. Les procédures NIR-PIT utilisant le modèle de cancer disséminé pleural sont faciles à comprendre et à réaliser. Pour mettre en place un modèle de dissémination de souris, utilisez de la mousse de polystyrène pour fabriquer un bouchon et désinfectez-le avec de l’éthanol à 70%.
Fixez l’aiguille au bouchon avec la pointe s’étendant à cinq millimètres du bouchon. Pliez la pointe d’une aiguille de calibre 30 avec une pince propre ou contre un objet dur nettoyé à 70% d’éthanol, et remplissez une seringue avec une fois 10 aux six cellules tumorales cibles dans 100 microlitres de PBS. Confirmer un manque de réponse au réflexe de pédale chez une souris nue anesthésiée, de 19 à 21 grammes, âgée de huit à 12 semaines, femelle, homozygote, athymique nue.
Insérez l’aiguille dans la poitrine à travers l’espace intercostal, en déplaçant l’aiguille de haut en bas pour éviter de contacter les côtes. Lorsque la pointe a traversé l’espace intercostal, positionnez la seringue de manière à ce qu’elle soit pressée contre la souris et injectez tout le volume des cellules cibles. Après l’injection, roulez la souris deux à trois fois pour répartir les cellules dans toute la cavité thoracique et ramenez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à récupération complète.
24 heures après l’injection de cellules et tous les jours par la suite, injecter aux souris anesthésisées injectées dans des cellules tumorales 200 microlitres de 15 milligrammes par millilitre de D-luciférine. Après 10 minutes, placez les souris dans un imageur de bioluminescence et ouvrez le Panneau de configuration d’acquisition dans le logiciel d’imagerie. Sélectionnez Luminescent, Photographie et Superposition.
Réglez le temps d’exposition sur Auto, le Binning sur Small, le F/Stop sur un pour Luminescent et sur huit pour Photograph, et le champ de vision sur C.Click Acquire pour imager la bioluminescence. Définissez le format d’affichage sur Radians et sélectionnez le cercle dans les outils De région d’intérêt du panneau Palette d’outils. Cliquez sur Mesurer les régions d’intérêt pour mesurer l’intensité bioluminescente de surface, puis utilisez Configurer la mesure pour sélectionner les valeurs pertinentes pour l’expérience.
Exportez cette table de données sous forme de fichier csv. Utilisez ensuite les valeurs de flux total pour la quantification de l’intensité bioluminescente dans le fichier. Avant d’effectuer une photothérapie dans le proche infrarouge des souris injectées dans la tumeur, utilisez un capteur de puissance pour mesurer la dose de lumière d’un laser de longueur d’onde de 690 nanomètres et ajustez la sortie à 100 milliwatts par centimètre carré.
24 heures avant le traitement, injecté par voie intraveineuse 100 microgrammes de conjugué photosensibilisant d’anticorps dans 50 à 200 microlitres de PBS via la veine caudale de l’animal injecté dans la tumeur. Le jour du traitement de photothérapie, placez la souris anesthésiée injectée par conjuguée et chargée de tumeurs en position couchée et protégez les sites non ciblés avec du papier d’aluminium. Lorsque tous les boucliers ont été placés, utilisez un laser de 100 joules par centimètre carré pour irradier la cavité thoracique avec une lumière proche infrarouge pendant environ 30 secondes.
Lorsque l’irradiation est terminée et que la souris s’est réveillée, ramenez l’animal dans sa cage et mesurez quotidiennement la bioluminescence comme démontré. Dans cette analyse représentative, la conjugaison de l’anticorps anti-podoplanine avec l’IR700 a été confirmée par l’analyse SDS-PAGE. Après l’injection de cellules tumorales, l’imagerie par bioluminescence et la tomographie par imagerie par luminescence diffuse doivent être effectuées pour déterminer quelles souris expriment une activité suffisante de la luciférase dans la cavité thoracique pour une étude plus approfondie.
Au cinquième jour après l’injection, les souris injectées par anticorps anti-podoplanine IR700 présentent une fluorescence IR700 élevée et une activité de la luciférase dans les tumeurs thoraciques, ce qui indique que l’anticorps conjugué IR700 injecté par voie intraveineuse atteint les sites tumoraux pleuraux disséminés. Notamment, les souris disséminées pleurales traitées par photoimmunothérapie dans le proche infrarouge démontrent une diminution de l’activité de la luciférase, tandis que les unités lumineuses relatives du groupe témoin présentent une augmentation progressive de l’intensité. Étant donné que l’énergie d’irradiation NIR requise dépend de la lignée cellulaire et des anticorps, assurez-vous de vérifier les conditions à l’avance in vitro.
