Les auteurs remercient Mme Lourdes Carreon G Tan pour son aide dans l’élevage du poisson. Ce travail a été financé par NMBU, Grants-in-Aid de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numéro de subvention 18H04881 et 18K19323), et une subvention pour des projets de recherche scientifique fondamentale de la Fondation Sumitomo à S.K.

Toutes les expérimentations et manipulations d’animaux ont été menées conformément aux recommandations sur le bien-être des animaux d’expérimentation à l’Université norvégienne des sciences de la vie. Les expériences utilisant la gonadectomie ont été approuvées par l’Autorité norvégienne de sécurité des aliments (FOTS ID 24305).
NOTE: Les expériences ont été réalisées en utilisant des hommes et des femmes adultes (âgés de 6 à 7 mois, poids d’environ 0,35 g, longueur d’environ 2,7 cm) medaka japonais. Le sexe a été déterminé en distinguant les caractéristiques sexuelles secondaires, telles que la taille et la forme de la nageoire dorsale et anale, comme décrit dans42,47.
1. Préparation des instruments et des solutions
<ol><li>Préparer une solution d’anesthésique (Tricaine à 0,6 %).<ol>
<li>Diluer 0,6 g de tricaïne (MS-222) dans 100 mL de solution saline tampon phosphate (PBS).</li>
		<li>Répartir 1 mL de la solution d’origine Tricaine dans plusieurs tubes en plastique de 1,5 mL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer l’eau de récupération (solution de NaCl à 0,9 %) en ajoutant 18 g de NaCl dans 2 L d’eau d’aquarium. Conserver la solution à température ambiante jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Préparez les outils d’incision en cassant un rasoir en diagonale pour obtenir un point pointu (Figure 1A).</li>
	<li>Préparer une solution anticoagulante sanguine (0,05 U/μL d’héparine de sodium) en diluant 25 μL d’héparine de sodium en 500 μL de 1x PBS. Conserver la solution anticoagulante à 4 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Préparer deux aiguilles en verre à partir d’un capillaire en verre de 90 mm de long en tirant un capillaire en verre à l’éventreur (Figure 1B) en suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: Le diamètre extérieur de l’aiguille en verre est de 1 mm, tandis que le diamètre intérieur est de 0,6 mm.</li>
	<li>Préparez un couvercle de tube en plastique de 1,5 mL en coupant le couvercle et faites un trou qui s’adapte au diamètre extérieur de l’aiguille (Figure 1C). Pour faire le trou, chauffez une extrémité du capillaire en verre de 9 mm et poignardez le capillaire en verre chauffé à travers le couvercle. Alternativement, utilisez une aiguille pour poignarder à travers le couvercle jusqu’à ce que le diamètre du trou s’adapte au capillaire en verre de 9 mm.</li>
</ol>2. Procédure de gonadectomie
<ol><li>Préparer 0,02% de solution anesthésique en diluant un tube de bouillon de Tricaine (0,6%) dans 30 mL d’eau d’aquarium.</li>
	<li>Préparez des outils de dissection comprenant une pince ultra-fine et deux pinces fines (une avec une pointe relativement large), de petits ciseaux, du fil de nylon et un rasoir comme décrit à l’étape 1.3.</li>
	<li>Anesthésiez le poisson en le mettant dans la solution anesthésique à 0,02% pendant 30 à 60 secondes. REMARQUE: La durée de l’anesthésie dépend de la taille et du poids du poisson et doit être adaptée. Pour s’assurer que le poisson est complètement anesthéséché, le corps du poisson peut être pincé doucement à l’aide d’une pince. Si le poisson ne réagit pas, la gonadectomie peut être commencée.</li>
	<li>Sortez le poisson de la solution anesthésique et placez-le horizontalement sur le côté, hors de l’eau sous un microscope à dissection.</li>
	<li>Ovariectomie (OVX) chez les femmes<ol>
<li>Retirez les œufs ovposités (œufs suspendus à l’extérieur du corps de la femelle) le cas échéant et grattez les écailles dans la zone d’incision (Figure 2A).</li>
		<li>Faites doucement une incision d’environ 2 à 2,5 mm de long entre les côtes, entre les nageoires pelvienne et anale (Figure 2A), à l’aide de la lame de rasoir. Ensuite, pincez doucement l’abdomen du poisson tout en sortant les ovaires petit à petit à l’aide d’une pince fine à pointe large.</li>
		<li>Coupez l’extrémité des ovaires à l’aide de pinces fines et placez les ovaires de côté (Figure 2B). REMARQUE: Veillez à ne pas casser le sac ovarien si possible. Si le sac ovarien est brisé, enlevez toute trace de gonace aussi complètement que possible sans laisser d’ovules non ovulés.</li>
	</ol></li>
	<li>Orchidectomie chez les hommes<ol>
<li>Faites doucement une incision entre les côtes au-dessus de l’anus (Figure 2A) et ouvrez l’incision lentement à l’aide d’une pince fine.</li>
		<li>Attrapez doucement les testicules à l’aide de la pince fine et retirez lentement les testicules. Ensuite, coupez l’extrémité des testicules pour enlever complètement les testicules (Figure 2B). Pour l’orchidectomie masculine, toutes les préparations sont similaires à chez les femelles jusqu’à la partie incision. Lors de la prise des testicules, on obtient parfois la graisse ressemblant aux testicules. Cependant, après avoir restauré la graisse, il est possible d’essayer de retrouver les testicules (Figure 2B). REMARQUE: Pour les hommes et les femmes, il est important de minimiser la taille de l’incision dans l’abdomen pour éviter des dommages excessifs pouvant entraîner la mortalité. Parfois, les intestins peuvent également apparaître à travers l’incision avec les gonailles, alors assurez-vous qu’ils sont correctement renvoyés à l’intérieur de l’incision avant la fermeture. Une connaissance préalable de l’emplacement des ovaires et des testicules dans l’abdomen medaka est essentielle.</li>
	</ol></li>
	<li>Suturez l’incision de la même manière chez les hommes et les femmes (Figure 3).<ol>
<li>Placez le fil de nylon à côté de la zone d’incision et poignardez la peau du côté droit de l’incision à travers la cavité interne du corps à l’aide d’une pince ultra-fine pour prendre le fil avec une pince fine (Figure 3; 1-2).</li>
		<li>Poignardez la peau du côté gauche de l’incision à travers la cavité externe du corps pour retirer le fil ( Figure 3; 3-4).</li>
		<li>Fermez l’ouverture de l’incision et faites deux nœuds et coupez le fil excessif (Figure 3; 4-6). REMARQUE: La suture doit être suffisamment serrée et le fil restant sur le poisson doit être assez long pour empêcher le desserrage de la suture. L’ensemble de la procédure, de l’anesthésie à la suture, prend généralement jusqu’à 6 minutes. Un temps plus long peut conduire à la mortalité.</li>
		<li>Mettez les poissons dans l’eau de récupération et laissez-les pendant au moins 24 heures avant de les transférer dans le système d’aquarium. REMARQUE: Les poissons gonadétomisés présentent généralement un comportement normal après 1-2 heures dans l’eau de récupération. Par conséquent, selon le but de l’expérience, on peut échantillonner le poisson après cet intervalle de temps.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procédure de prélèvement sanguin
<ol><li>Préparez les outils : une aiguille en verre, un capillaire en silicone, un tube en plastique avec un trou, un tube en plastique vide de 1,5 mL, une minicentrifugeuse et du ruban adhésif.</li>
	<li>Anesthésier le poisson à l’aide d’une solution anesthésique à 0,02 % décrite à l’étape 2.1 et placer le poisson sous un microscope à dissection en position verticale (Figure 4A). Placez le poisson sur une surface brillante pour faciliter la visualisation de la veine de ponction caudale.</li>
	<li>Installez le tiroir à sang en attachant une aiguille en verre au capillaire en silicone(Figure 4B). Casser la pointe de l’aiguille avec une pince à pointe large et recouvrir l’intérieur de l’aiguille d’une solution anticoagulante par aspiration et soufflage. REMARQUE: L’utilisation d’une ventouse et d’un capillaire en silicone d’au moins 50 cm de longueur est recommandée pour les mesures de sécurité afin d’éviter tout contact direct avec le sang lors de l’aspiration. De plus, assurez-vous que l’ouverture de la pointe de l’aiguille est suffisamment grande pour permettre de tirer le sang.</li>
	<li>Dirigez l’aiguille vers la zone du pédoncule du poisson, visez la veine du pédoncule caudal (Figure 5A) et prélevez le sang par la bouche jusqu’à ce qu’au moins un quart du volume total de l’aiguille soit rempli (Figure 5B). REMARQUE: Il est important d’arrêter d’aspirer avant de retirer l’aiguille du corps du poisson.</li>
	<li>Relâchez l’aiguille et placez un morceau de ruban adhésif à proximité du côté pointu de l’aiguille. Placez le couvercle avec un trou sur un tube de collecte et placez l’aiguille à l’intérieur du tube à travers le trou avec la pointe de l’aiguille à l’extérieur (Figure 5C).</li>
	<li>Mettez les poissons dans l’eau de récupération et laissez-les pendant au moins 24 heures avant de les transférer dans le système d’aquarium. REMARQUE: Pour effectuer un deuxième prélèvement sanguin sur le même poisson, échantillonnez le sang une semaine après le premier prélèvement sanguin.</li>
	<li>Flash faire tourner le sang recueilli pendant 1-2 secondes avec 1 000 x g à température ambiante pour recueillir le sang dans le tube.</li>
	<li>Passez directement aux applications en aval ou stockez le sang à -20 °C jusqu’à l’utilisation. REMARQUE: Se référer à l’étude précédente pour l’extraction de stéroïdes sexuels à partir du sangtotal 48.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme indiqué dans la littérature précédente, la gonadectomie et le prélèvement sanguin ont longtemps été utilisés chez d’autres espèces modèles pour étudier les questions liées au rôle des stéroïdes sexuels dans la régulation de l’axe BPG. Cependant, ces techniques ne semblent se prêter qu’aux animaux plus gros. Compte tenu de la petite taille du modèle de téléostéoscé couramment utilisé, le medaka japonais, nous fournissons un protocole détaillé pour la gonadectomie et le prélèvement s...

Chez les vertébrés, les stéroïdes sexuels, qui sont principalement produits par les gonds, jouent un rôle important dans la régulation de l’axe cerveau-hypophyse-gonadique (BPG) à travers divers mécanismes de rétroaction1,2,3,4,5. En outre, les stéroïdes sexuels affectent la prolifération et l’activité des neurones dans le cerveau6,7,8 et les cellules endocriniennes, y compris les gonadotrophes, dans l’hypophyse9,10, et jouent ainsi un rôle crucial dans la plasticité cérébrale et hypophysaire. Malgré des connaissances relativement bonnes chez les mammifères, le mécanisme de régulation de l’axe BPG médié par les stéroïdes sexuels est loin d’être compris chez les espèces non mammifères, ce qui conduit à une mauvaise compréhension des principes évolutifs conservés11. Il existe encore un nombre limité d’études documentant le rôle des stéroïdes sexuels sur la plasticité cérébrale et hypophysaire, ce qui soulève la nécessité d’études plus approfondies sur le rôle et les effets des stéroïdes sexuels sur diverses espèces de vertébrés.
Chez les vertébrés, les téléostéens sont devenus de puissants animaux modèles en abordant de nombreuses questions biologiques et physiologiques, notamment la réponse au stress12,13,la croissance14,15,la physiologie nutritionnelle16,17 et la reproduction2. Les téléostéens, dans lesquels les stéroïdes sexuels sont principalement représentés par l’œstradiol (E2) chez les femelles et la 11-cétotestostérone (11-KT) chez les mâles18,19, sont depuis longtemps des modèles expérimentaux fiables pour étudier le principe général de la reproduction entre les espèces. Les téléostéens montrent un caractère unique dans leur connexion hypothalamo-hypophysaire20,21 et leurs cellules gonadotrophes distinctes22,qui sont parfois pratiques pour l’élucidation des mécanismes de régulation. De plus, en raison de leur aptitude aux expériences en laboratoire et sur le terrain, les téléostéens offrent de nombreux avantages par rapport à d’autres organismes. Ils sont relativement peu coûteux à l’achat et àl’entretien23,24. En particulier, les petits modèles de téléostéens tels que le poisson-zèbre (Danio rerio) et le medaka japonais (Oryzias latipes), sont des espèces à très forte fécondité et à cycle de vie relativement court permettant une analyse rapide de la fonction des gènes et des mécanismes pathologiques23, offrant ainsi des avantages encore plus grands pour répondre à une pléthore de questions biologiques et physiologiques, compte tenu des nombreux protocoles bien développés et de la boîte à outils génétique disponible pour ces espèces25.
Dans de nombreuses études, l’élimination des gonacées (gonadectomie) ainsi que les techniques de prélèvement sanguin ont été utilisées comme méthode pour étudier de nombreuses questions physiologiques, y compris son impact sur la physiologie de la reproduction des vertébrés chez les mammifères26,27,28,les oiseaux29 et les amphibiens30. Bien que l’effet de la gondectomie sur la physiologie de la reproduction puisse être imité alternativement par les antagonistes des stéroïdes sexuels, tels que le tamoxifène et le clomifène, l’effet des médicaments semble être incohérent en raison des effets bimodinaux31,32. L’exposition chronique à un antagoniste des stéroïdes sexuels peut entraîner une hypertrophie ovarienne33,34, ce qui peut désactiver l’observation de ses effets à long terme en raison d’un phénotype malsain. En outre, il est impossible d’effectuer une expérience de récupération après un traitement antagoniste des stéroïdes sexuels, pour justifier l’effet spécifique de certains stéroïdes sexuels. En plus de ces points susmentionnés, d’autres compromis de l’utilisation d’antagonistes de stéroïdes sexuels ont été largement examinés31,32. Par conséquent, la gonadectomie apparaît encore aujourd’hui comme une technique puissante pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels.
Alors que les techniques de gonadectomie et de prélèvement sanguin sont relativement faciles à réaliser chez les espèces plus grandes, telles que le bar européen (Dicentrarchus labrax)35, le labre à tête bleue (Thalassoma bifasciatum)36, l’aiguillat commun (Scyliorhinus canicula)37 et le poisson-chat (Heteropneustes fossilis et Clarias bathracus)38,39, ils soulèvent des défis lorsqu’ils sont appliqués dans de petits poissons comme medaka. Par exemple, l’utilisation du système d’administration d’anesthésie pour poissons (FADS)40 est moins réalisable et semble sujette à des dommages physiques excessifs pour les petits poissons. En outre, une procédure de gonadectomie couramment utilisée pour les gros poissons40 ne convient pas aux petits poissons qui nécessitent une grande précision pour éviter des dommages excessifs. Enfin, le prélèvement sanguin est difficile en raison de l’accès limité aux vaisseaux sanguins et de la petite quantité de sang chez ces animaux. Par conséquent, un protocole clair démontrant chaque étape de la gonadectomie et du prélèvement sanguin dans un petit téléostéen est important.
Ce protocole démontre les procédures étape par étape de la gonadectomie suivie d’un prélèvement sanguin dans le medaka japonais, un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie de l’Est. Les medaka japonais ont un génome séquencé, plusieurs outils moléculaires et génétiques disponibles25,et un système de détermination génétique du sexe permettant d’enquêter sur les différences sexuelles avant que les caractéristiques sexuelles secondaires ou les gonas ne soient bien développées41. Fait intéressant, les medaka japonais possèdent des gonnes fusionnées contrairement à de nombreuses autres espèces de téléostéens42. Ces deux techniques combinées ne prennent que 8 minutes au total et compléteront la liste des protocoles vidéo déjà existants pour cette espèce qui comprenait le labeling des vaisseaux sanguins43,le patch-clamp sur les sections hypophysaires44 et les neurones cérébraux45,et la culture cellulaire primaire46. Ces techniques permettront à la communauté de recherche d’étudier et de mieux comprendre les rôles des stéroïdes sexuels dans les mécanismes de rétroaction ainsi que la plasticité cérébrale et hypophysaire à l’avenir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Les stéroïdes sexuels, produits par les gonfles, jouent un rôle essentiel dans la plasticité du cerveau et des tissus hypophysaires et dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction chez tous les vertébrés en fournissant une rétroaction au cerveau et à l’hypophyse. Les poissons téléostéens possèdent un degré plus élevé de plasticité tissulaire et de variation dans les stratégies de reproduction que les mammifères et semblent être des modèles utiles pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels et les mécanismes par lesquels ils agissent. L’élimination de la principale source de production de stéroïdes sexuels à l’aide de la gonadectomie avec un prélèvement sanguin pour mesurer les niveaux de stéroïdes a été bien établie et assez réalisable chez les gros poissons et est une technique puissante pour étudier le rôle et les effets des stéroïdes sexuels. Cependant, ces techniques soulèvent des défis lorsqu’elles sont mises en œuvre dans des modèles de téléostéen de petite taille. Ici, nous décrivons les procédures étape par étape de la gonadectomie chez les hommes et les femmes medaka japonais suivies d’un prélèvement sanguin. Ces protocoles se sont révélés hautement réalisables dans le medaka, ce qui indique un taux de survie élevé, la sécurité pour la durée de vie et le phénotype du poisson, et la reproductibilité en termes de clairance des stéroïdes sexuels. L’utilisation de ces procédures combinée aux autres avantages de l’utilisation de ce petit modèle de téléostéen améliorera considérablement la compréhension des mécanismes de rétroaction dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction et de la plasticité tissulaire fournis par les stéroïdes sexuels chez les vertébrés.

Ce protocole décrit chaque étape pour effectuer une gonadectomie et un prélèvement sanguin dans un téléostéen modèle de petite taille, le medaka japonais. Le taux de survie du poisson après ovariectomie (OVX) chez les femelles est de 100% (10 poissons sur 10) tandis que 94% (17 sur 18 poissons) des mâles ont survécu après une orchidectomie. Pendant ce temps, après la procédure de prélèvement sanguin, tous les poissons (38 poissons) ont survécu.
<p class="jove_content"...

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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

L’article décrit un protocole rapide pour gondécatomiser et prélassez le sang du petit poisson téléostéen, en utilisant le medaka japonais(Oryzias latipes)comme modèle, pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels dans la physiologie animale.

Gonadectomie et procédures de prélèvement sanguin dans le modèle de téléostéen de petite taille Medaka japonais (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.2K vues.  Norwegian University of Life Sciences. L’article décrit un protocole rapide pour gondécatomiser et prélassez le sang du petit poisson téléostéen, en utilisant le medaka japonais(Oryzias latipes)comme modèle, pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels dans la physiologie animale. 

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Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Non invasive In Vivo Petits animaux IRM et SRM: base des procédures expérimentales

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Recherche

Biologie

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

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Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation d&#39;embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

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Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

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Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Non-Terminal techniques d&#39;échantillonnage de sang chez les cobayes

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

L&#39;échantillonnage de sang de la veine caudale latérale de la Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Surveillance non invasive de la taille de la lésion dans un modèle murin hétérologues d’endométriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Quantification de l’ADN spécifique du porc circulant dans le sang d’un modèle de xénotransplantation

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...