Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

המחברים מודים לגברת לורדס קאריון ג'י טאן על עזרתה בבעלות הדגים. עבודה זו מומנה על ידי NMBU, מענקים בסיוע מהחברה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מספר 18H04881 ו- 18K19323), ומענק לפרויקטים בסיסיים לחקר המדע מקרן סומיטומו ל- S.K.

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי החיים הניסיונית באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים. ניסויים באמצעות כריתת גונדקטומיה אושרו על ידי הרשות הנורבגית לבטיחות מזון (FOTS ID 24305).
הערה: הניסויים בוצעו באמצעות זכר ונקבה בוגרים (6-7 חודשים, משקל כ 0.35 גרם, אורך כ 2.7 ס"מ) Medaka יפני. המין נקבע על ידי הבחנה המאפיינים המיניים המשניים, כגון גודל וצורה של סנפיר גב ואנאלי, כמתוארב 42,47.
1. הכנת מכשירים ופתרונות
<ol><li>הכן פתרון מלאי הרדמה (0.6% טריקיין).<ol>
<li>לדלל 0.6 גרם של Tricaine (MS-222) ב 100 מ"ל של 10x פוספט חוצץ מלוח (PBS).</li>
		<li>להפיץ 1 מ"ל של פתרון מלאי Tricaine לתוך כמה צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן מי התאוששות (0.9% פתרון NaCl) על ידי הוספת 18 גרם של NaCl לתוך 2 ליטר של מים באקווריום. יש לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר עד לשימוש.</li>
	<li>הכן את כלי החתך על ידי שבירת סכין גילוח באלכסון כדי לקבל נקודה חדה(איור 1A).</li>
	<li>הכן פתרון נוגד קרישה בדם (0.05 U/μL של נתרן הפרין) על ידי דילול 25 μL של נתרן הפרין לתוך 500 μL של 1x PBS. יש לאחסן את הפתרון נוגד קרישה ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.</li>
	<li>הכן שתי מחטי זכוכית מזכוכית באורך 90 מ"מ על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מחטים (איור 1B) בהתאם להוראות היצרן. הערה: הקוטר החיצוני של מחט הזכוכית הוא 1 מ"מ, בעוד הקוטר הפנימי הוא 0.6 מ"מ.</li>
	<li>הכן מכסה צינור פלסטיק בגודל 1.5 מ"ל על ידי חיתוך המכסה ובצע חור שמתאים לקוטר החיצוני של המחט(איור 1C). כדי להפוך את החור, לחמם קצה אחד של נימי זכוכית 9 מ"מ ולדקור את נימי הזכוכית מחומם דרך המכסה. לחלופין, להשתמש במחט כדי לדקור דרך המכסה עד קוטר החור מתאים עם נימי זכוכית 9 מ"מ.</li>
</ol>2. הליך כריתת גונדקטומיה
<ol><li>הכן 0.02% של פתרון הרדמה על ידי דילול צינור אחד של מניות Tricaine (0.6%) ב 30 מ"ל של מים אקווריום.</li>
	<li>הכן כלי ניתוח כולל מלקחיים דקים במיוחד ושני מלקחיים עדינים (אחד עם קצה רחב יחסית), מספריים קטנים, חוט ניילון ותער כמתואר בשלב 1.3.</li>
	<li>מרדים את הדג על ידי הכנסתו לתמיסת הרדמה של 0.02% למשך 30-60 שניות. הערה: משך ההרדמה תלוי בגודל ובמשקל של הדג ויש להתאים אותו. כדי להבטיח כי הדג הוא מרדים לחלוטין, גוף הדג ניתן לצבוט בעדינות באמצעות מלקחיים. אם הדג לא מגיב, ניתן להתחיל את כריתת הגונדקטומיה.</li>
	<li>מוציאים את הדגים מהתמיסה ההרדמה ומניחים את הדג אופקית על צידו, מחוץ למים תחת מיקרוסקופ הרדמה.</li>
	<li>כריתת אובלות (OVX) אצל נקבות<ol>
<li>יש להסיר ביצים (ביצים התלויות מחוץ לגוף הנקבה) אם בכלל ולגרד את המאזניים באזור החתכים(איור 2A).</li>
		<li>יש לבצע בעדינות חתך באורך של כ-2-2.5 מ"מ בין הצלעות, בין הסנפירים האגן לאנאלי(איור 2A),באמצעות סכין הגילוח. לאחר מכן, לצבוט בעדינות את הבטן דגים תוך לקיחת השחלות לאט לאט באמצעות מלקחיים עדינים עם קצה רחב.</li>
		<li>חותכים את קצה השחלות באמצעות מלקחיים עדינים ומניחים את השחלות בצד(איור 2B). הערה: יש להקפיד לא לשבור את שק השחלות במידת האפשר. אם שק השחלות שבור, הסר כל עקבות gonad לחלוטין ככל האפשר מבלי להשאיר אפילו כל ביצים שאינן ביוץ.</li>
	</ol></li>
	<li>כריתת סחלב אצל זכרים<ol>
<li>יש לבצע בעדינות חתוך בין הצלעות שמעל פי הטבעת (איור 2A), ולפתוח את החתירה באיטיות באמצעות מלקחיים עדינים.</li>
		<li>תפסו בעדינות את האשכים באמצעות המלקחיים העדינים ואיטיות הוציאו את האשכים. לאחר מכן, חתכו את קצה האשכים כדי להסיר לחלוטין את האשכים (איור 2B). לכריתת סחלבים זכרים, כל ההכנות דומות לנקבות עד לחלק ההחתכה. כאשר תופסים את האשכים, לפעמים השומן הדומה האשכים מתקבל. עם זאת, לאחר שחזור השומן, ניתן לנסות למצוא את האשכים שוב (איור 2B). הערה: הן עבור זכרים והן עבור נקבות, חשוב למזער את גודל ההסתה בבטן כדי למנוע נזק מוגזם שיכול להוביל לתמותה. לפעמים המעיים עשויים להופיע גם דרך ההסתעפות יחד עם הגונדים, כדי לוודא שהם מוחזרים כראוי בתוך ההסתעפות לפני הסגירה. ידע מוקדם על השחלות ומיקום האשכים בבטן מדאקה הוא חיוני.</li>
	</ol></li>
	<li>לתבל את החתירה באופן דומה אצל זכרים ונקבות(איור 3).<ol>
<li>מניחים את חוט הניילון ליד אזור ההשתכה ודוקרים את העור מצד ימין של ההשתכה דרך חלל הגוף הפנימי באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד כדי לקחת את החוט במלקחיים עדינים (איור 3;1-2).</li>
		<li>דקרו את העור מצד שמאל של ההסתעפות דרך חלל הגוף החיצוני כדי להוציא את החוט (איור 3;3-4).</li>
		<li>סגור את פתח החתך ובצע שני קשרים וחתוך את החוט המוגזם (איור 3;4-6). הערה: התפר חייב להיות הדוק כראוי, ואת החוט הנותר על הדג חייב להיות ארוך מספיק כדי למנוע התרופפות של התפר. כל ההליך מהרדמה עד תפירה בדרך כלל לוקח עד 6 דקות. זמן רב יותר עלול להוביל לתמותה.</li>
		<li>שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום. הערה: דג Gonadectomized בדרך כלל להראות התנהגות נורמלית לאחר 1-2 שעות במי ההתאוששות. לכן, בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לדגום את הדגים לאחר מרווח זמן זה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הליך דגימת דם
<ol><li>הכן את הכלים: מחט זכוכית, נימי סיליקון, צינור פלסטיק עם חור, צינור פלסטיק ריק 1.5 מ"ל, מיני צנטריפוגה וסרט הדבקה.</li>
	<li>יש להעשיר את הדגים באמצעות פתרון הרדמה של 0.02% כמתואר בשלב 2.1 ולהניח את הדגים מתחת למיקרוסקופ ניתוח במיקום אנכי (איור 4A). מניחים את הדג על משטח בהיר כדי להקל על ההדמיה של וריד הדקירה.</li>
	<li>התקן את מגירת הדם על ידי חיבור מחט זכוכית לנופלרי הסיליקון(איור 4B). לשבור את קצה המחט עם מלקחיים קצה רחב וציפוי החלק הפנימי של המחט עם פתרון נוגד קרישה על ידי שאיבה ופיצוץ. הערה: השימוש של פראייר נימי סיליקון עם אורך של לפחות 50 ס"מ מומלץ לאמצעי בטיחות כדי למנוע כל מגע ישיר של הדם בעת שאיבה. בנוסף, ודא כי פתיחת קצה המחט הוא גדול מספיק כדי לאפשר ציור הדם.</li>
	<li>כוון את המחט לכיוון אזור הדו-פדנקל של הדג, כוון לווריד הדו-פדונקל(איור 5A)ומשוך את הדם באמצעות הפה עד שלפחות רבע מהנפח הכולל של המחט יתמלא (איור 5B). הערה: חשוב להפסיק לניקה לפני הסרת המחט מגוף הדג.</li>
	<li>שחרר את המחט ולשים חתיכת קלטת בסמיכות של הצד החד של המחט. הניחו את המכסה עם חור בצינור איסוף והכניסו את המחט לתוך הצינור דרך החור עם קצה המחט מבחוץ(איור 5C).</li>
	<li>שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום. הערה: כדי לבצע דגימת דם שנייה מאותו דג, לדגום את הדם שבוע לאחר דגימת הדם הראשונה.</li>
	<li>פלאש לסובב את הדם שנאסף במשך 1-2 שניות עם 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הדם בצינור.</li>
	<li>המשך ישירות ליישומים במורד הזרם או לאחסן את הדם ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש. הערה: עיין במחקר הקודם עבור מיצוי סטרואידים סקס מכל הדם48.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כפי שדווח בספרות קודמת, gonadectomy ודגימה דם שימשו זמן רב במינים מודל אחרים כדי לחקור שאלות הקשורות לתפקיד של סטרואידים מיניים ברגולציה של ציר BPG. עם זאת, טכניקות אלה נראה מקובל רק עבור בעלי חיים גדולים יותר. בהתחשב בגודל הקטן של מודל הטלוסט הנפוץ, medaka יפנית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור gonadectomy...

בחולייתנים, סטרואידים מיניים, אשר מיוצרים בעיקר על ידי gonads, לשחק תפקידים חשובים ברגולציה של המוח-יותרת המוח-Gonadal (BPG) ציר באמצעות מנגנוני משוב שונים1,2,3,4,5. בנוסף, סטרואידים מיניים משפיעים על התפשטות ופעילות של נוירונים במוח6,7,8 ותאים אנדוקריניים, כולל גונדוטרופים, בבלוטת יותרת המוח9,10, ובכך משרתים תפקידים מכריעים בפלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח. למרות ידע טוב יחסית ביונקים, המנגנון של ויסות ציר BPG בתיווך סטרואידים מיניים רחוק מלהיות מובן במינים שאינם יונקים, מה שמוביל להבנה לקויה של עקרונות שמורים אבולוציוניים11. יש עדיין מספר מוגבל של מחקרים המתעדים את התפקיד של סטרואידים מיניים על המוח ופלסטיות יותרת המוח, ובכך להעלות את הצורך בחקירות נוספות של התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים על מינים בעלי חוליות מגוונים.
בקרב בעלי חוליות, teleosts הפכו חיות מודל חזקות בטיפול בשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות רבות, כולל תגובת מתח12,13, צמיחה14,15, פיזיולוגיה תזונתית16,17 ורבייה2. Teleosts, שבו סטרואידים מיני מיוצגים בעיקר על ידי אסטרדיול (E2) אצל נקבות ו 11-ketotestosterone (11-KT) אצל זכרים18,19, כבר זמן רב מודלים ניסיוניים אמינים לחקור את העיקרון הכללי של רבייה על פני מינים. Teleosts להראות ייחודיות שלהם חיבור ההיפותלמוס-יותרת המוח20,21 ותאי גונדוטרופים נפרדים22, אשר לפעמים נוחים להבהרת מנגנונים רגולטוריים. יתר על כן, בשל נוחותם הן לניסויי מעבדה והן לניסויים בשטח, טלוסטים מציעים יתרונות רבים בהשוואה לאורגניזמים אחרים. הם זולים יחסית לרכוש ולתחזק23,24. בפרט, מודלים טלוסט קטנים כגון דגיזברה (דניו rerio) ואת medaka היפני (Oryzias latipes),הם מינים עם פוריות גבוהה מאוד ומחזור חיים קצר יחסית המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד גנים ומנגנוני מחלות23,ובכך מספק יתרונות גדולים עוד יותר בטיפול בשפע של שאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, בהתחשב בפרוטוקולים המפותחים הרבים וארגז הכלים הגנטי הזמין למינים אלה25.
במחקרים רבים, הסרת gonads (gonadectomy) יחד עם טכניקות דגימת דם שימשו כשיטה לחקור שאלות פיזיולוגיות רבות, כולל השפעתה על פיזיולוגיה של פוריות חוליות ביונקים26,27,28, ציפורים29 ודו חיים30. למרות ההשפעה gonadectomy על פיזיולוגיה הרבייה יכול להיות לחילופין החיות על ידי אנטגוניסטים סטרואידים מין, כגון טמוקסיפן ו clomiphene, ההשפעה של התרופות נראה לא עקבי עקב השפעות bimodal31,32. חשיפה כרונית אנטגוניסט סטרואידים מין עלול להוביל להגדלת השחלות33,34, אשר עשוי להשבית תצפית של השפעותיו למטרות לטווח ארוך עקב פנוטיפ לא בריא. בנוסף, אי אפשר לבצע ניסוי התאוששות לאחר טיפול אנטגוניסט סטרואידים סקס, כדי להצדיק את ההשפעה הספציפית של סטרואידים מיניים מסוימים. יחד עם אלה נקודות הנ"ל, פשרות אחרות של שימוש אנטגוניסט סטרואידים סקס נבדקו בהרחבה31,32. לכן, gonadectomy עדיין מופיע היום כדכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים.
בעוד שטכניקות גונדכרטומיה ודגימה בדם קלות יחסית לביצוע במינים גדולים יותר, כגון בס ים אירופאי(Dicentrarchus labrax)35, ראסה ראש כחול(תלאסומה ביפסיאטום)36,דגי כלבים(Scyliorhinus)37 ושמנונים(Heteropneustes מאובנים וקלאריאס רחקוס)38,39,הם מעלים אתגרים כאשר מוחלים בדגים קטנים כמו medaka. לדוגמה, השימוש במערכת משלוח הרדמה דגים (FADS)40 הוא פחות ריאלי ונראה נוטה נזק פיזי מוגזם עבור דגים קטנים. בנוסף, הליך כריתת גונדקטומיה המשמש בדרך כלל לדגים גדולים יותר40 אינו מתאים לדגים קטנים הדורש דיוק גבוה כדי למנוע נזק מוגזם. לבסוף, דגימת דם היא מאתגרת בשל הגישה המוגבלת לכלי הדם וכמות הדם הקטנה בבעלי חיים אלה. לכן, פרוטוקול ברור המדגים כל שלב של כריתת גונדקטומיה ודגימה דם בטלוסט קטן הוא בעל חשיבות.
פרוטוקול זה מדגים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה ואחריו דגימת דם ב Medaka היפנית, דג מים מתוקים קטן שמקורו במזרח אסיה. Medaka היפני יש גנום רצף, כמה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25, ומערכת קביעת מין גנטי המאפשר לחקור הבדלים מיניים לפני מאפיינים מיניים משניים או gonads מפותחים היטב41. מעניין לציין שמדקה היפנית מחזיקה בגונדים מותכים בניגוד למינים טלוסטים רבים אחרים42. שתי טכניקות אלה יחד לקחת רק 8 דקות בסך הכל וישלים את הרשימה של פרוטוקולי וידאו כבר קיים עבור מין זה שכלל תיוג של כלי הדם43, מהדק תיקון על סעיפים יותרת המוח44 נוירונים במוח45, ותרבות תאיםראשונית 46. טכניקות אלה יאפשרו לקהילת המחקר לחקור ולהבין טוב יותר את התפקידים של סטרואידים מיניים במנגנוני משוב, כמו גם פלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח בעתיד.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

סטרואידים סקס, המיוצר על ידי האשכים, לשחק תפקיד חיוני במוח ורקמות יותרת המוח פלסטיות, בשליטה neuroendocrine של רבייה בכל בעלי החוליות על ידי מתן משוב למוח ובלוטות יותרת המוח. דגי טלוסט מחזיקים ברמה גבוהה יותר של פלסטיות רקמות וריאציה באסטרטגיות הרבייה בהשוואה ליונקים ונראה שהם מודלים שימושיים לחקור את תפקידם של סטרואידים מיניים ואת המנגנונים שבאמצעותם הם פועלים. הסרת המקור העיקרי של ייצור סטרואידים מיני באמצעות gonadectomy יחד עם דגימת דם כדי למדוד את רמות הסטרואידים כבר מבוסס היטב למדי אפשרי דגים גדולים יותר, היא טכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים. עם זאת, טכניקות אלה מעלות אתגרים כאשר מיושמות במודלים טלוסט בגודל קטן. כאן, אנו מתארים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה הן אצל זכרים והן אצל נקבה יפנית מדאקה ואחריו דגימת דם. פרוטוקולים אלה מוצגים להיות אפשרי מאוד medaka המצוין על ידי שיעור הישרדות גבוה, בטיחות על תוחלת החיים ואת פנוטיפ של הדג, רבייה במונחים של אישור סטרואידים מין. השימוש בהליכים אלה בשילוב עם היתרונות האחרים של שימוש במודל טלוסט קטן זה ישפר מאוד את ההבנה של מנגנוני משוב בשליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה ופלסטיות רקמות המסופקים על ידי סטרואידים מיניים בחולייתנים.

פרוטוקול זה מתאר כל צעד לביצוע כריתת גונדקטומיה ודגימה בדם בטלוסט מודל בגודל קטן, medaka היפני. שיעור ההישרדות של הדגים לאחר כריתת השחלות (OVX) אצל הנקבות הוא 100% (10 מתוך 10 דגים) ואילו 94% (17 מתוך 18 דגים) של הזכרים שרדו לאחר כריתת סחלב. בינתיים, לאחר שבוצע הליך דגימת הדם, שרדו כל הדגי...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים.

הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K Views.  Norwegian University of Life Sciences. המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים. 

Video: Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

מליחות תלויות Assay הרעילה של הכסף Nanocolloids שימוש Medaka ביצים

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>הליך משופר להשגת ביציות דגי זברה שלב I ללא תאי גרנולוזה

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model organism to investigate early developmental processes from oocyte to embryo. In zebrafish, oocytes are surrounded by a single layer of somatic granulosa cells. However, separating granulosa cells from oocytes poses a challenge, as achieving pure oocytes is crucial for precise analysis. Although various methods have been proposed to isolate zebrafish oocytes at different developmental stages, current techniques fall short in removing granulosa cells completely, limiting the accuracy of genome analysis focused solely on oocytes. In this study, we successfully developed a rapid and efficient process for isolating pure stage I oocytes in zebrafish while eliminating granulosa cell contamination. This technique facilitates biochemical and molecular analysis, particularly in exploring epigenetic and genome structure aspects specific to oocytes. Notably, the method is user-friendly, minimizes oocyte damage, and provides a practical solution for subsequent research and analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: שיטה משופרת לבידוד ביציות דגי זברה טהורים שלב I

This protocol describes a modified procedure for rapidly isolating clean stage I oocytes in zebrafish devoid of granulosa cells, thereby providing a convenient method for oocyte-specific research.

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מליחות תלויות Assay הרעילה של הכסף Nanocolloids שימוש Medaka ביצים

ותרופות טיפול

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס