Yazarlar Bayan Lourdes Carreon G Tan'a balık hayvanlığındaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma NMBU, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) Hibe-in-Aid (Hibe numarası 18H04881 ve 18K19323) ve Sumitomo Vakfı'ndan S.K.'ye Temel Bilim Araştırma Projeleri için hibe ile finanse edildi.

Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki deneysel hayvan refahı konusundaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Gonadektomi kullanılarak yapılan deneyler Norveç Gıda Güvenliği Kurumu (FOTS ID 24305) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Deneyler yetişkin erkek ve dişi (6-7 aylık, ağırlık yaklaşık 0,35 g, uzunluk yaklaşık 2,7 cm) Japon medaka kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. Cinsiyet,42,47'de açıklandığı gibi, dorsal ve anal yüzgecin büyüklüğü ve şekli gibi ikincil cinsel özellikleri ayırt ederek belirlendi.
1. Enstrümanlar ve çözüm hazırlama
<ol><li>Anestezik stok çözeltisi hazırlayın (%0,6 Trikain).<ol>
<li>0,6 g Tricaine (MS-222) 10x Fosfat Tampon Salin (PBS) 100 mL seyreltin.</li>
		<li>Tricaine stok çözeltisinin 1 mL'lik kısmını birkaç 1,5 mL plastik boruya dağıtın ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 L akvaryum suyuna 18 g NaCl ekleyerek geri kazanım suyu (%0,9 NaCl çözeltisi) hazırlayın. Çözeltiyi kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Keskin bir nokta elde etmek için bir jilet çapraz kırarak kesi aletlerini hazırlayın (Şekil 1A).</li>
	<li>25 μL sodyum heparini 500 μL 1x PBS'ye seyrelterek kan pıhtı önleyici çözelti (0,05 U/μL sodyum heparin) hazırlayın. Pıhtı önleyici çözeltiyi kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çekerek(Şekil 1B)cam kılcal damar çekerek 90 mm uzunluğundaki cam kılcal damardan iki cam iğne hazırlayın. NOT: Cam iğnenin dış çapı 1 mm, iç çapı ise 0,6 mm'dir.</li>
	<li>Kapağı keserek 1,5 mL plastik boru kapağı hazırlayın ve iğne dış çapına uygun bir delik açın (Şekil 1C). Deliği açmak için, 9 mm'lik cam kılcal damarın bir ucunun ısıtın ve ısıtılmış cam kılcal damarı kapaktan bıçaklayın. Alternatif olarak, deliğin çapı 9 mm'lik cam kılcal damara sığana kadar kapağı saplamak için bir iğne kullanın.</li>
</ol>2. Gonadektomi prosedürü
<ol><li>30 mL akvaryum suyunda bir tüp Tricaine stoğunu (%0,6) seyrelterek anestezik çözeltinin% 0,02'sini hazırlayın.</li>
	<li>Adım 1.3'te açıklandığı gibi bir ultra ince ve iki ince forseps (biri nispeten geniş uçlu), küçük makas, naylon iplik ve jilet dahil olmak üzere diseksiyon aletleri hazırlayın.</li>
	<li>Balığı 30-60 saniye boyunca% 0.02 anestezik çözeltiye koyarak uyuşturun. NOT: Anestezi süresi balığın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlıdır ve uyarlanmalıdır. Balığın tamamen uyuşturulmasını sağlamak için, balık gövdesi kümesler kullanılarak hafifçe sıkıştırılabilir. Balık tepki vermezse, gonadektomi başlatılabilir.</li>
	<li>Balıkları anestezik çözeltiden çıkar ve balığı yatay olarak yan tarafına, sudan diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin.</li>
	<li>Kadınlarda ovaerektomi (OVX)<ol>
<li>Varsa yumurtlama yumurtalarını (dişi vücudun dışına sarkan yumurtalar) çıkarın ve kesi alanındaki pulları kazıyın (Şekil 2A).</li>
		<li>Kaburgalar arasında, pelvik ve anal yüzgeçler arasında ( Şekil 2A ), jilet kullanarak yaklaşık2-2,5mm uzunluğunda bir kesi yapın. Daha sonra, geniş uçlu ince tokmakla yumurtalıkları azar azar çıkarırken balık karnını hafifçe çimdikleyin.</li>
		<li>İnce önlük kullanarak yumurtalıkların ucını kesin ve yumurtalıkları bir kenara yerleştirin (Şekil 2B). NOT: Mümkünse yumurtalık kesesini kırmamaya özenin. Yumurtalık kesesi kırılırsa, yumurtlanmamış yumurta bile bırakmadan gonad izlerini mümkün olduğunca tamamen çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Erkeklerde orkidektomi<ol>
<li>Anüs üzerindeki kaburgalar arasında hafifçe bir kesi yapın (Şekil 2A) ve ince tokmakla kesiği yavaşça açın.</li>
		<li>İnce toksları kullanarak testisleri yavaşça alın ve testisleri yavaşça dışarı alın. Daha sonra testisleri tamamen çıkarmak için testislerin ucunun kesilmesi (Şekil 2B). Erkek orkidektomi için, kesi kısmına kadar tüm preparatlar kadınlarda benzerdir. Testisleri tutarken, bazen testislere benzeyen yağ elde edilir. Bununla birlikte, yağı geri yükledikten sonra testisleri tekrar bulmaya çalışmak mümkündür (Şekil 2B). NOT: Hem erkekler hem de kadınlar için, mortaliteye yol açabilecek aşırı hasarı önlemek için karındaki kesi boyutunu en aza indirmek önemlidir. Bazen bağırsaklar da gonadlarla birlikte kesiden ortaya çıkabilir, bu nedenle kapanmadan önce kesi içinde düzgün bir şekilde geri döndüklerinden emin olun. Medaka karın bölgesinde yumurtalıklar ve testisler hakkında önceden bilgi sahibi olmak esastır.</li>
	</ol></li>
	<li>Kesiği erkeklerde ve kadınlarda benzer şekilde dikin (Şekil 3).<ol>
<li>Naylon ipliği kesi alanının yanına yerleştirin ve ince önlüklerle ipliği içeri almak için ultra ince önlük kullanarak derini kesiğin sağ tarafından iç vücut boşluğundan bıçaklayın (Şekil 3; 1-2).</li>
		<li>İpliği çıkarmak için kesiğin sol tarafındaki deriyi dış vücut boşluğundan bıçaklayın ( Şekil 3; 3-4).</li>
		<li>Kesi açıklığını kapatın ve iki düğüm yapın ve aşırı ipliği kesin (Şekil 3; 4-6). NOT: Dikiş yeterince sıkı olmalı ve balık üzerindeki kalan iplik dikişin gevşemesini önleyecek kadar uzun olmalıdır. Anesteziden dikişe kadar tüm işlem genellikle 6 dakika kadar sürer. Daha uzun süre ölüm oranına yol açabilir.</li>
		<li>Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin. NOT: Gonadektomi balıklar genellikle geri kazanım suyunda 1-2 saat sonra normal davranış gösterir. Bu nedenle, deney amacına bağlı olarak, bu zaman aralığından sonra balıkları örnekleyebilirsiniz.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kan örnekleme prosedürü
<ol><li>Aletleri hazırlayın: bir cam iğne, silikon kılcal damar, delikli plastik bir tüp, boş bir 1,5 mL plastik tüp, bir minicentrifuge ve bant.</li>
	<li>2.1. adımda açıklandığı gibi% 0.02 anestezik çözelti kullanarak balığı uyuşturun ve balıkları dikey bir konumda diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 4A). Kaudal delinme damarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için balığı parlak bir yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>Silikon kılcal damara cam iğne takarak kan çekmecesini takın (Şekil 4B). İğnenin ucunu geniş uçlu forsepslerle kırın ve iğnenin içini emiş ve üfleyerek pıhtı önleyici çözelti ile kaplayın. NOT: Emme sırasında kanın doğrudan temasını önlemek için güvenlik önlemleri için enayi ve en az 50 cm uzunluğunda silikon kılcal damar kullanılması önerilir. Ek olarak, iğne ucunun açıklığının kanın çizilmesine izin vermek için yeterince büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>İğneyi balığın peduncle bölgesine doğru yönlendirin, kaudal peduncle damarını hedefleyin (Şekil 5A) ve iğnenin toplam hacmi en az dörtte biri dolana kadar ağzı kullanarak kanı çekin (Şekil 5B). NOT: İğneyi balık vücudundan çıkarmadan önce emmeyi durdurmak önemlidir.</li>
	<li>İğneyi bırakın ve iğnenin keskin tarafının yakınlık kısmına bir bant parçası koyun. Kapağı bir toplama tüpüne bir delik ile yerleştirin ve iğneyi tüpün içine, iğne ucu dışarıda olacak şekilde delikten geçirin (Şekil 5C).</li>
	<li>Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin. NOT: Aynı balıktan ikinci bir kan örneği almak için, ilk kan örneklemesi yapıldıktan bir hafta sonra kanı örneklemek.</li>
	<li>Flash, tüpteki kanı toplamak için oda sıcaklığında 1.000 x g ile toplanan kanı 1-2 saniye boyunca aşağı çevirin.</li>
	<li>Doğrudan aşağı akış uygulamalarına geçin veya kullanıma kadar kanı -20 °C'de saklayın. NOT: Tüm kandan seks steroid ekstraksiyonu için önceki çalışmaya bakın48.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Önceki literatürde bildirildiği gibi, gonadektomi ve kan örneklemesi uzun zamandır BPG ekseninin düzenlenmesinde seks steroidlerinin rolü ile ilgili soruları araştırmak için diğer model türlerde kullanılmaktadır. Ancak, bu teknikler sadece daha büyük hayvanlar için uygun görünüyor. Yaygın olarak kullanılan teleost modeli Japon medaka'nın küçük boyutunu göz önünde bulundurarak, bu tür için mümkün olan gonadektomi ve kan örneklemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
<p class=...

Omurgalılarda, esas olarak gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, çeşitli geri bildirim mekanizmaları 1 ,2,3,4,5aracılığıyla Beyin-Hipofiz-Gonadal (BPG) ekseninin düzenlenmesinde önemli roller oynar. Ek olarak, seks steroidleri beyin6, 7,8ve endokrin hücrelerde nöronların çoğalmasını ve aktivitesini etkiler, gonadotroplar da dahil olmak üzere, hipofiz9,10ve böylece beyin ve hipofiz plastisitesinde önemli rollere hizmet eder. Memelilerde nispeten iyi bilgiye rağmen, seks steroidlerinin aracılık ettiği BPG ekseni düzenleme mekanizması, memeli olmayan türlerde anlaşılmaktan çok uzaktır ve evrimsel olarak korunan ilkelerin zayıf anlaşılmasına yol açar11. Hala beyin ve hipofiz plastisite üzerinde seks steroidlerin rolünü belgeleyen çalışmaların sınırlı sayıda vardır, böylece cinsiyet steroidlerin çeşitli omurgalı türler üzerindeki rolü ve etkileri hakkında daha fazla araştırma ihtiyacını artırmaktadır.
Omurgalılar arasında, teleostlar stres yanıtı 12 , 13 , büyüme 14 , 15 , beslenmefizyolojisi16,17ve üreme 2 dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik ve fizyolojik soruyu ele almada güçlü model hayvanlarhalinegelmiştir. Seks steroidlerinin çoğunlukla kadınlarda estradiol (E2) ve erkeklerde 11-ketotestosteron (11-KT) ile temsil edildiği teleostlar18,19, uzun zamandır türler arasında genel üreme ilkesini araştırmak için güvenilir deneysel modeller olmuştur. Teleostlar hipotalamik-hipofiz bağlantılarında benzersizlik gösterir20,21 ve farklı gonadotrop hücreleri22, bazen düzenleyici mekanizmaların aydınlatıcılığı için uygundur. Ayrıca, hem laboratuvar hem de saha deneylerine karşı saygınlıkları nedeniyle, teleostlar diğer organizmalara kıyasla birçok avantaj sunmaktadır. Satın almak ve korumak için nispetenucuzdurlar 23,24. Özellikle, zebra balığı (Danio rerio) ve Japon medaka (Oryzias latipes) gibi küçük teleost modelleri, çok yüksek doğurganlığa ve gen fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarının hızlı analizini sağlayan nispeten kısa bir yaşam döngüsüne sahip türlerdir23, böylece bu türler için mevcut olan çok sayıda iyi gelişmiş protokol ve genetik araç seti göz önüne alındığında, çok sayıda biyolojik ve fizyolojik sorunun ele alınmasında daha da büyük avantajlarsağlar.
Çok sayıda çalışmada, kan örnekleme teknikleri ile birlikte gonadların (gonadektomi) çıkarılması,memelilerdeomurgalı üreme fizyolojislerindeki etkisi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik soruyu araştırmak için bir yöntem olarak kullanılmıştır 26 ,27,28, kuşlar29 ve amfibiler30. Üreme fizyolojisi üzerindeki gonadektomi etkisi alternatif olarak tamoksifen ve klomifen gibi seks steroid antagonistleri tarafından taklit edilebilse de, ilaçların etkisi bimodal etkiler nedeniyle tutarsız görünüyor31,32. Bir seks steroid antagonist kronik maruz kalma yumurtalık büyütme yol açabilir33,34, hangi sağlıksız bir fenotip nedeniyle uzun vadeli amaçlar için etkilerinin gözlem devre dışı bırakabilir. Ek olarak, bazı seks steroidlerinin spesifik etkisini garanti etmek için seks steroid antagonist tedavisinden sonra bir kurtarma deneyi yapmak imkansızdır. Yukarıda belirtilen puanlarla birlikte, seks steroid antagonist kullanımının diğer takasları kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir31,32. Bu nedenle, gonadektomi bugün hala seks steroidlerinin rolünü araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.
Gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerinin daha büyük türlerde uygulanması nispeten kolay olsa da, Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 ve yayın balığı (Heteropneustes fossilis ve Clarias bathracus)38,39, medaka olarak küçük balıklarda uygulandığında zorlukları gündeme getiriyorlar. Örneğin, Balık Anestezi Doğum Sistemi (FADS)40'ın kullanımı daha az uygulanabilir ve küçük balıklar için aşırı fiziksel hasara eğilimli görünmektedir. Ek olarak, daha büyükbalıklar 40 için yaygın olarak kullanılan bir gonadektomi prosedürü, aşırı hasarı önlemek için yüksek hassasiyet gerektiren küçük balıklar için uygun değildir. Son olarak, kan damarlarına sınırlı erişim ve bu hayvanlardaki az miktarda kan nedeniyle kan örneklemesi zordur. Bu nedenle, küçük bir teleostta gonadektomi ve kan örneklemenin her adımını gösteren açık bir protokol önemlidir.
Bu protokol, Doğu Asya'ya özgü küçük bir tatlı su balığı olan Japon medakasında kan örneklemesi ile takip edilen gonadektomi işlemlerinin adım adım prosedürlerini göstermektedir. Japon medaka sıralı bir genoma, mevcut birkaç moleküler ve genetik alete sahiptir25ve ikincil cinsel özellikler veya gonadlar iyi geliştirilmeden önce cinsel farklılıkların araştırılmasına izin sağlayan genetik bir cinsiyet belirleme sistemi41. İlginçtir ki, Japon medaka diğer birçok teleost türüne aksine kaynaşmış gonadlara sahiptir42. Bu iki teknik bir araya geldiğinde toplamda sadece 8 dakika sürer ve kan damarlarının etiketlenini içeren bu tür için zaten mevcut olan video protokollerinin listesinitamamlayacaktır 43, hipofiz bölümleri44 ve beyin nöronları45ve birincil hücre kültürü46. Bu teknikler araştırma topluluğunun geri bildirim mekanizmalarının yanı sıra gelecekte beyin ve hipofiz plastisitesinde seks steroidlerinin rollerini araştırmasını ve daha iyi anlamasını sağlayacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, beyin ve hipofiz doku plastisitesinde ve beyin ve hipofiz geri bildirim sağlayarak tüm omurgalılarda üremenin nöroendokrin kontrolünde önemli bir rol oynar. Teleost balıkları, memeliler ile karşılaştırıldığında üreme stratejilerinde daha yüksek derecede doku plastisitesine ve varyasyona sahiptir ve seks steroidlerinin rolünü ve hareket ettikleri mekanizmaları araştırmak için yararlı modeller gibi görünmektedir. Steroid seviyelerini ölçmek için kan örneklemesi ile birlikte gonadektomi kullanarak seks steroid üretiminin ana kaynağının kaldırılması iyi kurulmuş ve daha büyük balık oldukça uygulanabilir olmuştur ve seks steroidlerin rolünü ve etkilerini araştırmak için güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknikler küçük boyutlu teleost modellerinde uygulandığında zorlukları gündeme getirmektedir. Burada, hem erkeklerde hem de dişi Japon medakasında gonadektomi ve ardından kan örneklemesi gibi adım adım yapılan işlemleri açıklıyoruz. Bu protokoller yüksek hayatta kalma oranı, balıkların yaşam süresi ve fenotip için güvenlik ve seks steroid boşluk açısından tekrarlanabilirlik ile belirtilen medaka son derece uygulanabilir olarak gösterilmiştir. Bu prosedürlerin kullanımı, bu küçük teleost modelini kullanmanın diğer avantajları ile birlikte, omurgalılarda cinsiyet steroidleri tarafından sağlanan üreme ve doku plastisitesinin nöroendokrin kontrolünde geri bildirim mekanizmalarının anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirecektir.

Bu protokol, Japon medaka'sı olan küçük boyutlu bir model teleostunda gonadektomi ve kan örneklemesi yapmak için atılan her adımı açıklar. Kadınlarda ovaerektomi (OVX) sonrası balıkların hayatta kalma oranı %100'dür (10 balıktan 10'u), orkideektomi sonrası erkeklerin %94'ü (18 balıktan 17'si) hayatta kalmıştır. Bu arada, kan örnekleme işlemi yapıldıktan sonra, tüm (38 balık) balık hayatta kaldı.
S...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar.

Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.2K Görüntüleme.  Norwegian University of Life Sciences. Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar. 

Video: Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Noninvaziv In Vivo Küçük Hayvan MRG ve MRS: Temel Deneysel Prosedürler

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Biyoloji

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Kobaylardaki Sigara Terminal Kan Örnekleme Teknikleri

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Lezyon boyutu endometriozis, kapaklı fare modeli noninvaziv izlenmesi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Knenotransplantasyon Modelinin KanLarında Dolaşan Domuza Özgü DNA'nın Ölçülmesi

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...