Gli autori ringraziano la signora Lourdes Carreon G Tan per la sua assistenza nella zootecnia. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU, Grants-in-Aid from Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant number 18H04881 e 18K19323), e grant for Basic Science Research Projects dalla Sumitomo Foundation a S.K.

Tutte le sperimentazioni e la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le raccomandazioni sul benessere animale sperimentale presso l'Università norvegese di scienze della vita. Gli esperimenti con gonadectomia sono stati approvati dall'Autorità norvegese per la sicurezza alimentare (FOTS ID 24305).
NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando medaka giapponesi maschi e femmine adulti (6-7 mesi, peso circa 0,35 g, lunghezza circa 2,7 cm). Il sesso è stato determinato distinguendo le caratteristiche sessuali secondarie, come la dimensione e la forma della pinna dorsale e anale, come descritto in42,47.
1. Preparazione di strumenti e soluzioni
<ol><li>Preparare la soluzione stock anestetica (0,6% di tricaina).<ol>
<li>Diluire 0,6 g di tricaina (MS-222) in 100 mL di 10x soluzione salina tampone fosfato (PBS).</li>
		<li>Distribuire 1 mL della soluzione stock di Tricaina in diversi tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 °C fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare l'acqua di recupero (soluzione di NaCl 0,9%) aggiungendo 18 g di NaCl in 2 L di acqua dell'acquario. Conservare la soluzione a temperatura ambiente fino all'uso.</li>
	<li>Preparare gli strumenti di incisione rompendo un rasoio in diagonale per ottenere un punto acuto (Figura 1A).</li>
	<li>Preparare una soluzione anticoagulante nel sangue (0,05 U/μL di eparina sodica) diluendo 25 μL di eparina sodica in 500 μL di 1x PBS. Conservare la soluzione anticoagulante a 4 °C fino all'uso.</li>
	<li>Preparare due aghi di vetro da un capillare di vetro lungo 90 mm tirando un capillare di vetro con un estrattore di aghi (Figura 1B) seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: il diametro esterno dell'ago di vetro è di 1 mm, mentre il diametro interno è di 0,6 mm.</li>
	<li>Preparare un coperchio del tubo di plastica da 1,5 ml tagliando il coperchio e praticare un foro che si adatti al diametro esterno dell'ago (Figura 1C). Per fare il foro, riscaldare un'estremità del capillare di vetro da 9 mm e pugnalare il capillare di vetro riscaldato attraverso il coperchio. In alternativa, utilizzare un ago per pugnalare il coperchio fino a quando il diametro del foro si adatta al capillare di vetro da 9 mm.</li>
</ol>2. Procedura di gonadectomia
<ol><li>Preparare lo 0,02% di soluzione anestetica diluendo un tubo di brodo di tricaina (0,6%) in 30 ml di acqua dell'acquario.</li>
	<li>Preparare strumenti di dissezione tra cui una pinza ultra-fine e due sottili (una con punta relativamente larga), piccole forbici, filo di nylon e rasoio come descritto al punto 1.3.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce mettendolo nella soluzione anestetica allo 0,02% per 30-60 secondi. NOTA: La durata dell'anestesia dipende dalle dimensioni e dal peso del pesce e deve essere adattata. Per garantire che il pesce sia completamente anestetizzato, il corpo del pesce può essere pizzicato delicatamente usando una pinza. Se il pesce non reagisce, la gonadectomia può essere avviata.</li>
	<li>Esponi il pesce dalla soluzione anestetica e posiziona il pesce orizzontalmente su un lato, fuori dall'acqua sotto un microscopio di dissezione.</li>
	<li>Ovariectomia (OVX) nelle femmine<ol>
<li>Rimuovere le uova ovopositate (uova appese all'esterno del corpo femminile) se presenti e raschiare le squame nell'area dell'incisione (Figura 2A).</li>
		<li>Fare delicatamente un'incisione lunga circa 2-2,5 mm tra le costole, tra le pinne pelvica e anale (Figura 2A), usando la lama del rasoio. Quindi, pizzicare delicatamente l'addome del pesce mentre si esano le ovaie a poco a poco usando una pinna fine con punta larga.</li>
		<li>Tagliare l'estremità delle ovaie usando una pinna fine e mettere da parte le ovaie (Figura 2B). NOTA: Fare attenzione a non rompere il sacco ovarico, se possibile. Se il sacco ovarico è rotto, rimuovere eventuali tracce di gonne il più completamente possibile senza lasciare nemmeno uova non ovulate.</li>
	</ol></li>
	<li>Orchidectomia nei maschi<ol>
<li>Fare delicatamente un'incisione tra le costole sopra l'ano (Figura 2A) e aprire lentamente l'incisione usando una pinica fine.</li>
		<li>Afferrare delicatamente i testicoli usando la pincitta fine e lentamente togliere i testicoli. Successivamente, tagliare l'estremità dei testicoli per rimuovere completamente i testicoli (Figura 2B). Per l'orchidectomia maschile, tutti i preparati sono simili alle femmine fino alla parte di incisione. Quando si afferrano i testicoli, a volte si ottiene il grasso simile ai testicoli. Tuttavia, dopo aver ripristinato il grasso, è possibile provare a trovare nuovamente i testicoli (Figura 2B). NOTA: Sia per i maschi che per le femmine, è importante ridurre al minimo la dimensione dell'incisione nell'addome per prevenire danni eccessivi che possono portare alla mortalità. A volte l'intestino può anche apparire attraverso l'incisione insieme alle gondi, quindi assicurati che siano correttamente restituite all'interno dell'incisione prima della chiusura. È essenziale una conoscenza preliminare della posizione delle ovaie e dei testicoli nell'addome medaka.</li>
	</ol></li>
	<li>Suturare l'incisione in modo simile nei maschi e nelle femmine (Figura 3).<ol>
<li>Posizionare il filo di nylon accanto all'area dell'incisione e pugnalare la pelle dal lato destro dell'incisione attraverso la cavità interna del corpo usando una pinza ultra-fine per inserire il filo con una pinza fine (Figura 3; 1-2).</li>
		<li>Pugnalare la pelle dal lato sinistro dell'incisione attraverso la cavità esterna del corpo per eliminare il filo ( Figura 3; 3-4).</li>
		<li>Chiudere l'apertura dell'incisione e fare due nodi e tagliare il filo in eccesso (Figura 3; 4-6). NOTA: la sutura deve essere adeguatamente stretta e il filo rimanente sul pesce deve essere abbastanza lungo da impedire l'allentamento della sutura. L'intera procedura dall'anestesia fino alla sutura richiede comunemente fino a 6 minuti. Un tempo più lungo può portare alla mortalità.</li>
		<li>Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. NOTA: i pesci gonadectomizzati di solito mostrano un comportamento normale dopo 1-2 ore nell'acqua di recupero. Pertanto, a seconda dello scopo dell'esperimento, è possibile campionare il pesce dopo questo intervallo di tempo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedura di prelievo del sangue
<ol><li>Preparare gli strumenti: un ago di vetro, un capillare in silicone, un tubo di plastica con un foro, un tubo di plastica vuoto da 1,5 ml, un minicentrifuga e nastro.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce con una soluzione anestetica allo 0,02% come descritto nel passaggio 2.1 e posizionare il pesce sotto un microscopio di dissezione in posizione verticale (Figura 4A). Posizionare il pesce su una superficie luminosa per facilitare la visualizzazione della vena caudale di puntura.</li>
	<li>Installare il cassetto del sangue attaccando un ago di vetro al capillare in silicone (Figura 4B). Rompere la punta dell'ago con una pinna a punta larga e rivestire l'interno dell'ago con una soluzione anticoagulante aspirando e soffiando. NOTA: L'uso di una ventosa e di un capillare in silicone con almeno 50 cm di lunghezza sono raccomandati per le misure di sicurezza per evitare qualsiasi contatto diretto del sangue durante l'aspirazione. Inoltre, assicurarsi che l'apertura della punta dell'ago sia sufficientemente grande da consentire il prelievo del sangue.</li>
	<li>Dirigere l'ago verso l'area del peduncolo del pesce, mirare alla vena del peduncolo caudale (Figura 5A) e prelevare il sangue usando la bocca fino a riempire almeno un quarto del volume totale dell'ago (Figura 5B). NOTA: È importante interrompere l'aspirazione prima di rimuovere l'ago dal corpo del pesce.</li>
	<li>Rilasciare l'ago e mettere un pezzo di nastro in prossimità del lato affilato dell'ago. Posizionare il coperchio con un foro su un tubo di raccolta e mettere l'ago all'interno del tubo attraverso il foro con la punta dell'ago all'esterno (Figura 5C).</li>
	<li>Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. NOTA: Per eseguire un secondo prelievo di sangue dallo stesso pesce, campionare il sangue una settimana dopo il primo prelievo di sangue.</li>
	<li>Flash spin down il sangue raccolto per 1-2 secondi con 1.000 x g a temperatura ambiente per raccogliere il sangue nel tubo.</li>
	<li>Procedere direttamente alle applicazioni a valle o conservare il sangue a -20 °C fino all'uso. NOTA: Fare riferimento allo studio precedente per l'estrazione di steroidi sessuali dal sangue intero48.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come riportato nella letteratura precedente, la gonadectomia e il prelievo di sangue sono stati a lungo utilizzati in altre specie modello per indagare domande relative al ruolo degli steroidi sessuali nella regolazione dell'asse BPG. Tuttavia, queste tecniche sembrano essere suscettibili solo per gli animali più grandi. Considerando le piccole dimensioni del modello di teleosteo comunemente usato, il medaka giapponese, forniamo un protocollo dettagliato per la gonadectomia e il prelievo di sangue che è fattibile per q...

Nei vertebrati, gli steroidi sessuali, che sono prodotti principalmente dalle gonadi, svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'asse cervello-ipofisi-gonadi (BPG) attraverso vari meccanismi di feedback1,2,3,4,5. Inoltre, gli steroidi sessuali influenzano la proliferazione e l'attività dei neuroni nel cervello6,7,8 e le cellule endocrine, compresi i gonadotropi, nell'ipofisi9,10e quindi svolgono ruoli cruciali nel cervello e nella plasticità ipofisaria. Nonostante le conoscenze relativamente buone nei mammiferi, il meccanismo di regolazione dell'asse BPG mediato dagli steroidi sessuali è ben lungi dall'essere compreso nelle specie non mammifere, portando a una scarsa comprensione dei principi evolutivi conservati11. C'è ancora un numero limitato di studi che documentano il ruolo degli steroidi sessuali sul cervello e sulla plasticità ipofisaria, aumentando così la necessità di ulteriori indagini sul ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali su diverse specie di vertebrati.
Tra i vertebrati, i teleostei sono diventati potenti animali modello nell'affrontare numerose domande biologiche e fisiologiche, tra cui la risposta allo stress12,13,la crescita 14,15,la fisiologia nutrizionale16,17 e la riproduzione2. I teleostei, in cui gli steroidi sessuali sono per lo più rappresentati da estradiolo (E2) nelle femmine e 11-chetotestosterone (11-KT) nei maschi18,19, sono stati a lungo modelli sperimentali affidabili per indagare il principio generale della riproduzione tra le specie. I teleostei mostrano unicità nella loro connessione ipotalamo-ipofisaria20,21 e distinte cellule gonadotrope22, che a volte sono convenienti per la delucidazione dei meccanismi di regolazione. Inoltre, grazie alla loro suscettibilità sia agli esperimenti di laboratorio che a quello sul campo, i teleostei offrono molti vantaggi rispetto ad altri organismi. Sono relativamente poco costosi da acquistare e mantenere23,24. In particolare, piccoli modelli di teleostei come il pesce zebra (Danio rerio) e il giapponese medaka (Oryzias latipes), sono specie con una fecondità molto elevata e un ciclo di vita relativamente breve che consente una rapida analisi della funzione genica e dei meccanismi di malattia23, fornendo così vantaggi ancora maggiori nell'affrontare una pletora di questioni biologiche e fisiologiche, considerando i numerosi protocolli ben sviluppati e toolkit genetici disponibili per queste specie25.
In numerosi studi, la rimozione delle gonidi (gonadectomia) insieme alle tecniche di prelievo del sangue sono state utilizzate come metodo per indagare molte questioni fisiologiche, incluso il suo impatto nella fisiologia riproduttiva dei vertebrati nei mammiferi26,27,28,uccelli29 e anfibi30. Sebbene l'effetto della gonadectomia sulla fisiologia riproduttiva possa essere alternativamente imitato da antagonisti degli steroidi sessuali, come il tamoxifene e il clomifene, l'effetto dei farmaci sembra essere incoerente a causa degli effetti bimodali31,32. L'esposizione cronica a un antagonista steroideo sessuale può portare all'allargamentoovarico33,34, che può disabilitare l'osservazione dei suoi effetti a lungo termine a causa di un fenotipo malsano. Inoltre, è impossibile eseguire un esperimento di recupero dopo il trattamento con antagonisti degli steroidi sessuali, per garantire l'effetto specifico di alcuni steroidi sessuali. Insieme a questi punti di cui sopra, altri compromessi dell'uso di antagonisti di steroidi sessuali sono stati ampiamente rivisti31,32. Pertanto, la gonadectomia appare ancora oggi come una potente tecnica per indagare il ruolo degli steroidi sessuali.
Mentre la gonadectomia e le tecniche di prelievo del sangue sono relativamente facili da eseguire in specie più grandi, come il branzino europeo (Dicentrarchus labrax)35, il labbro blu (Thalassoma bifasciatum)36, il pesce cane (Scyliorhinus canicula)37 e il pesce gatto (Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)38,39, sollevano sfide quando applicati in piccoli pesci come medaka. Ad esempio, l'uso del Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 è meno fattibile e sembra essere soggetto a danni fisici eccessivi per i piccoli pesci. Inoltre, una procedura di gonadectomia comunemente usata per i pesci più grandi40 non è adatta per i pesci piccoli che richiedono un'elevata precisione per evitare danni eccessivi. Infine, il prelievo di sangue è impegnativo a causa dell'accesso limitato ai vasi sanguigni e della piccola quantità di sangue in quegli animali. Pertanto, un protocollo chiaro che dimostri ogni fase della gonadectomia e del prelievo di sangue in un piccolo teleosteo è importante.
Questo protocollo dimostra le procedure passo-passo della gonadectomia seguite dal prelievo di sangue nel medaka giapponese, un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia orientale. I medaka giapponesi hanno un genoma sequenziato, diversi strumenti molecolari e genetici disponibili25e un sistema di determinazione genetica del sesso che consente di esaminare le differenze sessuali prima che le caratteristiche sessuali secondarie o le gonde siano ben sviluppate41. È interessante notare che i medaka giapponesi possiedono gondi fuse contrariamente a molte altre specie di teleostei42. Queste due tecniche combinate richiedono solo 8 minuti in totale e completeranno l'elenco dei protocolli video già esistenti per questa specie che includeva l'etichettatura dei vasi sanguigni43, patch-clamp sulle sezioni ipofisarie44 e neuroni cerebrali45e la coltura cellulare primaria46. Queste tecniche consentiranno alla comunità di ricerca di indagare e comprendere meglio i ruoli degli steroidi sessuali nei meccanismi di feedback, nonché la plasticità cerebrale e ipofisaria in futuro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Gli steroidi sessuali, prodotti dalle gonidi, svolgono un ruolo essenziale nella plasticità del cervello e del tessuto ipofisario e nel controllo neuroendocrino della riproduzione in tutti i vertebrati fornendo feedback al cervello e all'ipofisi. I pesci teleostei possiedono un più alto grado di plasticità tissutale e variazione nelle strategie riproduttive rispetto ai mammiferi e sembrano essere modelli utili per indagare il ruolo degli steroidi sessuali e i meccanismi con cui agiscono. La rimozione della principale fonte di produzione di steroidi sessuali utilizzando la gonadectomia insieme al prelievo di sangue per misurare i livelli di steroidi è stata ben consolidata e abbastanza fattibile nei pesci più grandi ed è una tecnica potente per indagare il ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali. Tuttavia, queste tecniche sollevano sfide se implementate in modelli di teleostei di piccole dimensioni. Qui, descriviamo le procedure passo-passo della gonadectomia sia nei maschi che nelle femmine di medaka giapponese seguite da prelievo di sangue. Questi protocolli si sono dimostrati altamente fattibili in medaka indicato da un alto tasso di sopravvivenza, sicurezza per la durata della vita e fenotipo del pesce e riproducibilità in termini di clearance degli steroidi sessuali. L'uso di queste procedure combinato con gli altri vantaggi dell'utilizzo di questo piccolo modello di teleosteo migliorerà notevolmente la comprensione dei meccanismi di feedback nel controllo neuroendocrino della riproduzione e della plasticità tissutale fornita dagli steroidi sessuali nei vertebrati.

Questo protocollo descrive ogni fase per l'esecuzione della gonadectomia e del prelievo di sangue in un teleosteo modello di piccole dimensioni, il medaka giapponese. Il tasso di sopravvivenza del pesce dopo ovariectomia (OVX) nelle femmine è del 100% (10 su 10 pesci) mentre il 94% (17 su 18 pesci) dei maschi è sopravvissuto dopo orchidectomia. Nel frattempo, dopo che è stata eseguita la procedura di prelievo del sangue, tutti i pesci (38 pesci) sono sopravvissuti.
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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale.

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.2K Views.  Norwegian University of Life Sciences. L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale. 

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Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

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Ricerca

Biologia

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

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Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

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Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

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Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

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Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Non terminale Tecniche di prelievo di sangue in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Prelievo di sangue dalla vena della coda laterale del Topo

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Monitoraggio non invasivo della dimensione della lesione in un modello murino eterologo di endometriosi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...