Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gli autori ringraziano la signora Lourdes Carreon G Tan per la sua assistenza nella zootecnia. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU, Grants-in-Aid from Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant number 18H04881 e 18K19323), e grant for Basic Science Research Projects dalla Sumitomo Foundation a S.K.

Tutte le sperimentazioni e la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le raccomandazioni sul benessere animale sperimentale presso l'Università norvegese di scienze della vita. Gli esperimenti con gonadectomia sono stati approvati dall'Autorità norvegese per la sicurezza alimentare (FOTS ID 24305).
NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando medaka giapponesi maschi e femmine adulti (6-7 mesi, peso circa 0,35 g, lunghezza circa 2,7 cm). Il sesso è stato determinato distinguendo le caratteristiche sessuali secondarie, come la dimensione e la forma della pinna dorsale e anale, come descritto in42,47.
1. Preparazione di strumenti e soluzioni
<ol><li>Preparare la soluzione stock anestetica (0,6% di tricaina).<ol>
<li>Diluire 0,6 g di tricaina (MS-222) in 100 mL di 10x soluzione salina tampone fosfato (PBS).</li>
		<li>Distribuire 1 mL della soluzione stock di Tricaina in diversi tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 °C fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare l'acqua di recupero (soluzione di NaCl 0,9%) aggiungendo 18 g di NaCl in 2 L di acqua dell'acquario. Conservare la soluzione a temperatura ambiente fino all'uso.</li>
	<li>Preparare gli strumenti di incisione rompendo un rasoio in diagonale per ottenere un punto acuto (Figura 1A).</li>
	<li>Preparare una soluzione anticoagulante nel sangue (0,05 U/μL di eparina sodica) diluendo 25 μL di eparina sodica in 500 μL di 1x PBS. Conservare la soluzione anticoagulante a 4 °C fino all'uso.</li>
	<li>Preparare due aghi di vetro da un capillare di vetro lungo 90 mm tirando un capillare di vetro con un estrattore di aghi (Figura 1B) seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: il diametro esterno dell'ago di vetro è di 1 mm, mentre il diametro interno è di 0,6 mm.</li>
	<li>Preparare un coperchio del tubo di plastica da 1,5 ml tagliando il coperchio e praticare un foro che si adatti al diametro esterno dell'ago (Figura 1C). Per fare il foro, riscaldare un'estremità del capillare di vetro da 9 mm e pugnalare il capillare di vetro riscaldato attraverso il coperchio. In alternativa, utilizzare un ago per pugnalare il coperchio fino a quando il diametro del foro si adatta al capillare di vetro da 9 mm.</li>
</ol>2. Procedura di gonadectomia
<ol><li>Preparare lo 0,02% di soluzione anestetica diluendo un tubo di brodo di tricaina (0,6%) in 30 ml di acqua dell'acquario.</li>
	<li>Preparare strumenti di dissezione tra cui una pinza ultra-fine e due sottili (una con punta relativamente larga), piccole forbici, filo di nylon e rasoio come descritto al punto 1.3.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce mettendolo nella soluzione anestetica allo 0,02% per 30-60 secondi. NOTA: La durata dell'anestesia dipende dalle dimensioni e dal peso del pesce e deve essere adattata. Per garantire che il pesce sia completamente anestetizzato, il corpo del pesce può essere pizzicato delicatamente usando una pinza. Se il pesce non reagisce, la gonadectomia può essere avviata.</li>
	<li>Esponi il pesce dalla soluzione anestetica e posiziona il pesce orizzontalmente su un lato, fuori dall'acqua sotto un microscopio di dissezione.</li>
	<li>Ovariectomia (OVX) nelle femmine<ol>
<li>Rimuovere le uova ovopositate (uova appese all'esterno del corpo femminile) se presenti e raschiare le squame nell'area dell'incisione (Figura 2A).</li>
		<li>Fare delicatamente un'incisione lunga circa 2-2,5 mm tra le costole, tra le pinne pelvica e anale (Figura 2A), usando la lama del rasoio. Quindi, pizzicare delicatamente l'addome del pesce mentre si esano le ovaie a poco a poco usando una pinna fine con punta larga.</li>
		<li>Tagliare l'estremità delle ovaie usando una pinna fine e mettere da parte le ovaie (Figura 2B). NOTA: Fare attenzione a non rompere il sacco ovarico, se possibile. Se il sacco ovarico è rotto, rimuovere eventuali tracce di gonne il più completamente possibile senza lasciare nemmeno uova non ovulate.</li>
	</ol></li>
	<li>Orchidectomia nei maschi<ol>
<li>Fare delicatamente un'incisione tra le costole sopra l'ano (Figura 2A) e aprire lentamente l'incisione usando una pinica fine.</li>
		<li>Afferrare delicatamente i testicoli usando la pincitta fine e lentamente togliere i testicoli. Successivamente, tagliare l'estremità dei testicoli per rimuovere completamente i testicoli (Figura 2B). Per l'orchidectomia maschile, tutti i preparati sono simili alle femmine fino alla parte di incisione. Quando si afferrano i testicoli, a volte si ottiene il grasso simile ai testicoli. Tuttavia, dopo aver ripristinato il grasso, è possibile provare a trovare nuovamente i testicoli (Figura 2B). NOTA: Sia per i maschi che per le femmine, è importante ridurre al minimo la dimensione dell'incisione nell'addome per prevenire danni eccessivi che possono portare alla mortalità. A volte l'intestino può anche apparire attraverso l'incisione insieme alle gondi, quindi assicurati che siano correttamente restituite all'interno dell'incisione prima della chiusura. È essenziale una conoscenza preliminare della posizione delle ovaie e dei testicoli nell'addome medaka.</li>
	</ol></li>
	<li>Suturare l'incisione in modo simile nei maschi e nelle femmine (Figura 3).<ol>
<li>Posizionare il filo di nylon accanto all'area dell'incisione e pugnalare la pelle dal lato destro dell'incisione attraverso la cavità interna del corpo usando una pinza ultra-fine per inserire il filo con una pinza fine (Figura 3; 1-2).</li>
		<li>Pugnalare la pelle dal lato sinistro dell'incisione attraverso la cavità esterna del corpo per eliminare il filo ( Figura 3; 3-4).</li>
		<li>Chiudere l'apertura dell'incisione e fare due nodi e tagliare il filo in eccesso (Figura 3; 4-6). NOTA: la sutura deve essere adeguatamente stretta e il filo rimanente sul pesce deve essere abbastanza lungo da impedire l'allentamento della sutura. L'intera procedura dall'anestesia fino alla sutura richiede comunemente fino a 6 minuti. Un tempo più lungo può portare alla mortalità.</li>
		<li>Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. NOTA: i pesci gonadectomizzati di solito mostrano un comportamento normale dopo 1-2 ore nell'acqua di recupero. Pertanto, a seconda dello scopo dell'esperimento, è possibile campionare il pesce dopo questo intervallo di tempo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedura di prelievo del sangue
<ol><li>Preparare gli strumenti: un ago di vetro, un capillare in silicone, un tubo di plastica con un foro, un tubo di plastica vuoto da 1,5 ml, un minicentrifuga e nastro.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce con una soluzione anestetica allo 0,02% come descritto nel passaggio 2.1 e posizionare il pesce sotto un microscopio di dissezione in posizione verticale (Figura 4A). Posizionare il pesce su una superficie luminosa per facilitare la visualizzazione della vena caudale di puntura.</li>
	<li>Installare il cassetto del sangue attaccando un ago di vetro al capillare in silicone (Figura 4B). Rompere la punta dell'ago con una pinna a punta larga e rivestire l'interno dell'ago con una soluzione anticoagulante aspirando e soffiando. NOTA: L'uso di una ventosa e di un capillare in silicone con almeno 50 cm di lunghezza sono raccomandati per le misure di sicurezza per evitare qualsiasi contatto diretto del sangue durante l'aspirazione. Inoltre, assicurarsi che l'apertura della punta dell'ago sia sufficientemente grande da consentire il prelievo del sangue.</li>
	<li>Dirigere l'ago verso l'area del peduncolo del pesce, mirare alla vena del peduncolo caudale (Figura 5A) e prelevare il sangue usando la bocca fino a riempire almeno un quarto del volume totale dell'ago (Figura 5B). NOTA: È importante interrompere l'aspirazione prima di rimuovere l'ago dal corpo del pesce.</li>
	<li>Rilasciare l'ago e mettere un pezzo di nastro in prossimità del lato affilato dell'ago. Posizionare il coperchio con un foro su un tubo di raccolta e mettere l'ago all'interno del tubo attraverso il foro con la punta dell'ago all'esterno (Figura 5C).</li>
	<li>Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. NOTA: Per eseguire un secondo prelievo di sangue dallo stesso pesce, campionare il sangue una settimana dopo il primo prelievo di sangue.</li>
	<li>Flash spin down il sangue raccolto per 1-2 secondi con 1.000 x g a temperatura ambiente per raccogliere il sangue nel tubo.</li>
	<li>Procedere direttamente alle applicazioni a valle o conservare il sangue a -20 °C fino all'uso. NOTA: Fare riferimento allo studio precedente per l'estrazione di steroidi sessuali dal sangue intero48.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come riportato nella letteratura precedente, la gonadectomia e il prelievo di sangue sono stati a lungo utilizzati in altre specie modello per indagare domande relative al ruolo degli steroidi sessuali nella regolazione dell'asse BPG. Tuttavia, queste tecniche sembrano essere suscettibili solo per gli animali più grandi. Considerando le piccole dimensioni del modello di teleosteo comunemente usato, il medaka giapponese, forniamo un protocollo dettagliato per la gonadectomia e il prelievo di sangue che è fattibile per questa specie.
Il fatto che il tasso di sopravvivenza dei pesci gonadectomizzati abbia raggiunto quasi il 100% indica che la procedura di gonadectomia è fattibile da applicare su medaka. Allo stesso modo, la procedura di prelievo del sangue non influisce sulla sopravvivenza del pesce, come dimostrato dal tasso di sopravvivenza del 100% dopo aver subito questa procedura. Inoltre, le femmine operate da sham allevate insieme ai maschi con chirurgia fittizia mostrano ovideposizione e uova fecondate al 100%, indicando che l'incisione e la procedura di sutura non influenzano la riproduzione del pesce. In altre parole, erano abbastanza sani da deporre le uova. Inoltre, i pesci parzialmente gonadectomizzati mostrano concentrazioni comparabili di steroidi sessuali ai pesci operati da sham, e l'ovideposizione in alcune femmine e la fecondazione delle uova da parte dei maschi sono state osservate in quei pesci parzialmente gonadectomizzati. Questi risultati suggeriscono che la procedura di gonadectomia deve essere eseguita con alta precisione, il che significa che le ovaie o i testicoli devono essere completamente rimossi.
Come mostrato nella Figura 8,l'incisione e il segno di sutura sul pesce sono completamente scomparsi 4 settimane dopo la gonadectomia e i pesci sono ancora vivi e sembrano sani 4 mesi dopo l'intervento chirurgico. Questi indicano che la procedura operativa è sicura per il pesce per scopi a lungo termine e non influisce sulla durata della vita del pesce. Inoltre, dopo 4 mesi, non sono state osservate gondi. Ciò è confermato dai bassi livelli di E2 e 11-KT che sono ancora simili a quelli trovati nei pesci gonadectomizzati dopo 24 ore.
I livelli di E2 e 11-KT nei pesci gonadectomizzati sono significativamente più bassi rispetto ai pesci operati da sham, già dopo 24 ore dopo la gonadectomia e rimangono più bassi nei pesci campionati 4 mesi dopo la gonadectomia. I livelli significativamente più bassi di steroidi sessuali nei pesci gonadectomizzati rispetto al controllo sono stati osservati in studi precedenti nel pesce cane37,pesce gatto39 e medaka48. Queste prove coerenti suggeriscono che la procedura di gonadectomia descritta nel protocollo è una tecnica affidabile per eliminare gli steroidi sessuali circolanti.
Poiché questa procedura non si basa sulla FADS come dimostrato in40, la gonadectomia deve essere eseguita il più rapidamente possibile per prevenire la mortalità durante l'intervento chirurgico. Infatti, l'uso di FADS consente di mantenere il ritmo di funzionamento poiché questo strumento consente una condizione anestetica continua al pesce nonostante sia esposto all'aria. Tuttavia, a causa della sua minore fattibilità nel piccolo teleosteo come medaka, l'uso di FADS non può essere eseguito con pesci di quelle dimensioni. Inoltre, a differenza del precedente protocollo di gonadectomia nei pesci più grandi che consente un'ampia incisione per raggiungere la gonna, il protocollo descritto in questo manoscritto non consente un'ampia incisione per evitare danni eccessivi al piccolo pesce. Pertanto, si dovrebbe stare molto attenti quando si cerca di accedere alla gonna usando una pinna per prevenire danni in altri tessuti all'interno della cavità del corpo del pesce.
Il protocollo si basa su una procedura rapida e pulita. L'allenamento è quindi altamente raccomandato fino al raggiungimento di un alto tasso di successo, indicato da un alto tasso di sopravvivenza del pesce dopo gonadectomia nonché dalla completa rimozione delle gonali (vedi la differenza di aspetto morfologico e anatomico del pesce prima e dopo gonadectomia di successo in Figura 7). In effetti, molti fattori possono influenzare il tasso di successo della procedura, tra cui il periodo di anestesia, l'ampia entità dell'incisione, l'accuratezza e l'ordine della sutura e la manipolazione del pesce durante la procedura. Un altro punto importante è che si dovrebbe preparare pesce sano mantenendo il pesce in modo ottimale prima di eseguire il protocollo.
Per quanto riguarda la procedura di prelievo del sangue, gli studi precedenti hanno tentato di campionare il sangue da medaka48 e zebrafish49,50,51, ma la procedura non consente il campionamento ripetuto del sangue nello stesso pesce poiché il sangue viene prelevato dopo l'eutanasia del pesce. Ripetuti prelievi di sangue sono stati dimostrati utilizzando zebrafish in un altro studio52, ma riportiamo questo tipo di protocollo per la prima volta in medaka.
La valutazione delle concentrazioni di steroidi sessuali viene comunemente effettuata utilizzando un kit di test immunoassorbiente enzimatico (ELISA) e ci sono stati molti kit ELISA disponibili in commercio per diversi tipi di steroidi sessuali. A causa della bassa quantità di sangue raccolto durante il prelievo di sangue, i saggi a valle sono destinati al sangue intero. Studi precedenti hanno dimostrato che esiste una differenza nel livello misurato dei livelli di steroidi circolanti estratti dal sangue intero e dal plasma53,54. Pertanto, la differenza nei livelli di steroidi sessuali dal sangue intero e plasma deve essere convalidata prima di eseguire l'esperimento reale utilizzando il protocollo.
Come documentato in studi precedenti con diversi modelli animali, il protocollo qui descritto permetterà di indagare questioni relative alla fisiologia riproduttiva utilizzando come modello un teleosteo di piccole dimensioni. Infatti, queste tecniche hanno già contribuito a rispondere a domande riguardanti la regolazione dell'asse BPG e dei suoi meccanismi di feedback, come il coinvolgimento di kiss1 (gene kisspeptin di tipo 1) che esprimono neuroni in cicli di feedbackpositivi 55, regolazione mediata da estrogeni di kiss1 che esprimo neuroni nel nucleo ventralis tuberis (NVT) e kiss2 (gene kisspeptin di tipo 2) che esprimono neuroni nell'area preottica (POA)56, 57, il possibile coinvolgimento del recettore degli estrogeni β1 (Esr2a) nella down-regolazione del livello di espressione di fsh nella medaka58 giapponese femminile e il profilo del ritmo circadiano di E2 nel pesce femmina48. Inoltre, poiché studi precedenti hanno dimostrato che gli steroidi sessuali influenzano anche la proliferazione delle cellule gonadotrope nell'ipofisi dei teleostei59,60,è intrigante indagare gli effetti della clearance degli steroidi sessuali dopo gonadectomia sulla plasticità ipofisaria.
La tecnica di campionamento del sangue non solo può essere utilizzata per l'analisi degli steroidi sessuali, ma anche per altre analisi del contenuto di sangue, compresi i livelli di glucosio nel sangue. In effetti, il protocollo può essere applicato anche per le misurazioni della glicemia come dimostrato in zebrafish52 e medaka61. Pertanto, questa tecnica può essere ampliata per affrontare domande di ricerca in altri campi della fisiologia.
Infine, i protocolli qui descritti sono destinati e ottimizzati per il medaka giapponese adulto e i risultati dovuti alle diverse dimensioni dei pesci e dei materiali utilizzati durante le procedure possono variare. Inoltre, poiché medaka le ovaie / testicoli sinistro e destro sono fusi, il che potrebbe fornire un importante vantaggio per la gonadectomia, questo protocollo potrebbe richiedere diversi adattamenti prima di essere utilizzato in altre specie in cui questo non è il caso come nel pesce zebra. Pertanto, un'ottimizzazione in base alla scelta delle attrezzature di laboratorio e delle dimensioni del pesce dovrebbe essere presa in considerazione prima di testare questi protocolli.

Nei vertebrati, gli steroidi sessuali, che sono prodotti principalmente dalle gonadi, svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'asse cervello-ipofisi-gonadi (BPG) attraverso vari meccanismi di feedback1,2,3,4,5. Inoltre, gli steroidi sessuali influenzano la proliferazione e l'attività dei neuroni nel cervello6,7,8 e le cellule endocrine, compresi i gonadotropi, nell'ipofisi9,10e quindi svolgono ruoli cruciali nel cervello e nella plasticità ipofisaria. Nonostante le conoscenze relativamente buone nei mammiferi, il meccanismo di regolazione dell'asse BPG mediato dagli steroidi sessuali è ben lungi dall'essere compreso nelle specie non mammifere, portando a una scarsa comprensione dei principi evolutivi conservati11. C'è ancora un numero limitato di studi che documentano il ruolo degli steroidi sessuali sul cervello e sulla plasticità ipofisaria, aumentando così la necessità di ulteriori indagini sul ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali su diverse specie di vertebrati.
Tra i vertebrati, i teleostei sono diventati potenti animali modello nell'affrontare numerose domande biologiche e fisiologiche, tra cui la risposta allo stress12,13,la crescita 14,15,la fisiologia nutrizionale16,17 e la riproduzione2. I teleostei, in cui gli steroidi sessuali sono per lo più rappresentati da estradiolo (E2) nelle femmine e 11-chetotestosterone (11-KT) nei maschi18,19, sono stati a lungo modelli sperimentali affidabili per indagare il principio generale della riproduzione tra le specie. I teleostei mostrano unicità nella loro connessione ipotalamo-ipofisaria20,21 e distinte cellule gonadotrope22, che a volte sono convenienti per la delucidazione dei meccanismi di regolazione. Inoltre, grazie alla loro suscettibilità sia agli esperimenti di laboratorio che a quello sul campo, i teleostei offrono molti vantaggi rispetto ad altri organismi. Sono relativamente poco costosi da acquistare e mantenere23,24. In particolare, piccoli modelli di teleostei come il pesce zebra (Danio rerio) e il giapponese medaka (Oryzias latipes), sono specie con una fecondità molto elevata e un ciclo di vita relativamente breve che consente una rapida analisi della funzione genica e dei meccanismi di malattia23, fornendo così vantaggi ancora maggiori nell'affrontare una pletora di questioni biologiche e fisiologiche, considerando i numerosi protocolli ben sviluppati e toolkit genetici disponibili per queste specie25.
In numerosi studi, la rimozione delle gonidi (gonadectomia) insieme alle tecniche di prelievo del sangue sono state utilizzate come metodo per indagare molte questioni fisiologiche, incluso il suo impatto nella fisiologia riproduttiva dei vertebrati nei mammiferi26,27,28,uccelli29 e anfibi30. Sebbene l'effetto della gonadectomia sulla fisiologia riproduttiva possa essere alternativamente imitato da antagonisti degli steroidi sessuali, come il tamoxifene e il clomifene, l'effetto dei farmaci sembra essere incoerente a causa degli effetti bimodali31,32. L'esposizione cronica a un antagonista steroideo sessuale può portare all'allargamentoovarico33,34, che può disabilitare l'osservazione dei suoi effetti a lungo termine a causa di un fenotipo malsano. Inoltre, è impossibile eseguire un esperimento di recupero dopo il trattamento con antagonisti degli steroidi sessuali, per garantire l'effetto specifico di alcuni steroidi sessuali. Insieme a questi punti di cui sopra, altri compromessi dell'uso di antagonisti di steroidi sessuali sono stati ampiamente rivisti31,32. Pertanto, la gonadectomia appare ancora oggi come una potente tecnica per indagare il ruolo degli steroidi sessuali.
Mentre la gonadectomia e le tecniche di prelievo del sangue sono relativamente facili da eseguire in specie più grandi, come il branzino europeo (Dicentrarchus labrax)35, il labbro blu (Thalassoma bifasciatum)36, il pesce cane (Scyliorhinus canicula)37 e il pesce gatto (Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)38,39, sollevano sfide quando applicati in piccoli pesci come medaka. Ad esempio, l'uso del Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 è meno fattibile e sembra essere soggetto a danni fisici eccessivi per i piccoli pesci. Inoltre, una procedura di gonadectomia comunemente usata per i pesci più grandi40 non è adatta per i pesci piccoli che richiedono un'elevata precisione per evitare danni eccessivi. Infine, il prelievo di sangue è impegnativo a causa dell'accesso limitato ai vasi sanguigni e della piccola quantità di sangue in quegli animali. Pertanto, un protocollo chiaro che dimostri ogni fase della gonadectomia e del prelievo di sangue in un piccolo teleosteo è importante.
Questo protocollo dimostra le procedure passo-passo della gonadectomia seguite dal prelievo di sangue nel medaka giapponese, un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia orientale. I medaka giapponesi hanno un genoma sequenziato, diversi strumenti molecolari e genetici disponibili25e un sistema di determinazione genetica del sesso che consente di esaminare le differenze sessuali prima che le caratteristiche sessuali secondarie o le gonde siano ben sviluppate41. È interessante notare che i medaka giapponesi possiedono gondi fuse contrariamente a molte altre specie di teleostei42. Queste due tecniche combinate richiedono solo 8 minuti in totale e completeranno l'elenco dei protocolli video già esistenti per questa specie che includeva l'etichettatura dei vasi sanguigni43, patch-clamp sulle sezioni ipofisarie44 e neuroni cerebrali45e la coltura cellulare primaria46. Queste tecniche consentiranno alla comunità di ricerca di indagare e comprendere meglio i ruoli degli steroidi sessuali nei meccanismi di feedback, nonché la plasticità cerebrale e ipofisaria in futuro.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Gli steroidi sessuali, prodotti dalle gonidi, svolgono un ruolo essenziale nella plasticità del cervello e del tessuto ipofisario e nel controllo neuroendocrino della riproduzione in tutti i vertebrati fornendo feedback al cervello e all'ipofisi. I pesci teleostei possiedono un più alto grado di plasticità tissutale e variazione nelle strategie riproduttive rispetto ai mammiferi e sembrano essere modelli utili per indagare il ruolo degli steroidi sessuali e i meccanismi con cui agiscono. La rimozione della principale fonte di produzione di steroidi sessuali utilizzando la gonadectomia insieme al prelievo di sangue per misurare i livelli di steroidi è stata ben consolidata e abbastanza fattibile nei pesci più grandi ed è una tecnica potente per indagare il ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali. Tuttavia, queste tecniche sollevano sfide se implementate in modelli di teleostei di piccole dimensioni. Qui, descriviamo le procedure passo-passo della gonadectomia sia nei maschi che nelle femmine di medaka giapponese seguite da prelievo di sangue. Questi protocolli si sono dimostrati altamente fattibili in medaka indicato da un alto tasso di sopravvivenza, sicurezza per la durata della vita e fenotipo del pesce e riproducibilità in termini di clearance degli steroidi sessuali. L'uso di queste procedure combinato con gli altri vantaggi dell'utilizzo di questo piccolo modello di teleosteo migliorerà notevolmente la comprensione dei meccanismi di feedback nel controllo neuroendocrino della riproduzione e della plasticità tissutale fornita dagli steroidi sessuali nei vertebrati.

Questo protocollo descrive ogni fase per l'esecuzione della gonadectomia e del prelievo di sangue in un teleosteo modello di piccole dimensioni, il medaka giapponese. Il tasso di sopravvivenza del pesce dopo ovariectomia (OVX) nelle femmine è del 100% (10 su 10 pesci) mentre il 94% (17 su 18 pesci) dei maschi è sopravvissuto dopo orchidectomia. Nel frattempo, dopo che è stata eseguita la procedura di prelievo del sangue, tutti i pesci (38 pesci) sono sopravvissuti.
Le femmine con ovidetà (Figura 6A) e tutte le uova sono state fecondate e consentite per lo sviluppo embrionale (Figura 6B). I maschi operati da Sham sono stati anche in grado di fecondare le uova dopo solo 1-2 settimane. Due delle sei femmine parzialmente gonadectomizzate allevate con maschi parzialmente gonadectomizzati hanno anche mostrato ovideposizione con il 100% di uova fecondate dopo 2 mesi. Al contrario, nessuna ovodeposizione nelle femmine o fecondazione da parte dei maschi è stata osservata nei pesci completamente gonadectomizzati, anche dopo 4 mesi.
Se eseguita correttamente, la forma del corpo del pesce cambia leggermente (Figura 7A) e nessun pezzo di gonadi deve rimanere dopo la procedura di gonadectomia (Figura 7B). Nel frattempo, 4 settimane dopo la gonadectomia, l'incisione e la sutura sono completamente scomparse (Figura 8), e dopo 4 mesi, tutti i pesci gonadectomizzati mostravano ancora fenotipo sano e non è stato trovato tessuto gonadico.
Le concentrazioni ematiche di E2 nelle femmine (Tabella 1), misurate con ELISA seguendo le istruzioni del produttore, hanno rivelato che il livello di E2 nei pesci OVX è significativamente inferiore rispetto ai pesci operati da sham 24 ore dopo l'intervento chirurgico (p < 0,00001). Dopo 4 mesi, il livello di E2 nei pesci OVX è anche significativamente inferiore rispetto ai pesci a base di sham(p < 0,00001) e non mostra differenze significative rispetto a quello in 24 ore di pesce post-OVX(p > 0,05). Infine, in parte i pesci OVX, dove è stato rimosso solo da 1/3 a 1/2 della gonadi, mostrano livelli di E2 significativamente più bassi rispetto ai pesci a base di sham (p = 0,0437) e livelli di E2 significativamente più alti rispetto ai pesci completamente OVX (p < 0,00001) (Figura 9A).
Allo stesso modo nei maschi (Tabella 1), la concentrazione di 11-KT nei pesci orchidectomizzati è significativamente inferiore rispetto ai pesci operati da sham 24 ore dopo l'intervento chirurgico (p < 0,00001). Il livello di 11-KT nei pesci orchidectomizzati dopo 4 mesi è anche significativamente inferiore rispetto ai pesci operati da sham(p < 0,00001) e non mostra alcuna differenza rispetto ai pesci post-orchidectomizzati di 24 ore(p > 0,05). Infine, i pesci parzialmente orchidectomizzati mostrano livelli significativamente più bassi di 11-KT rispetto ai pesci operati da sham(p = 0,0428) e livelli significativamente più alti di 11-KT rispetto ai pesci completamente orchidectomizzati (p < 0,00001) (Figura 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig01.jpg"> Figura 1. Preparazione dello strumento. (A) Lama di rasoio per gonadectomia, (B) ago di vetro per l'estrazione del sangue e (C) un tubo di plastica insieme a un coperchio con un foro per la raccolta del sangue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig02.jpg"> Figura 2. Posizione dell'area di incisione. A)Disegno dell'area di incisione situata tra le costole, tra le pinne pelvica e anale nelle femmine (pannello di sinistra) e nei maschi (pannello di destra); B)rimozione delle gonne nelle femmine (pannello di sinistra) e nei maschi (pannello di destra), cerchi bianchi che mostrano la parte articolare, freccia bianca che mostra il testicolo e freccia nera che mostra il grasso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig03.jpg"> Figura 3. La procedura di sutura. 1) Un foro viene praticato sul lato destro dell'incisione utilizzando una pinica ultra-fine. 2) Il filo di nylon viene fatto passare attraverso la pelle usando il foro fatto in 1. 3) Un foro è fatto nel lato sinistro dell'incisione. 4) Il filo di nylon viene fatto passare attraverso il foro fatto in 3. 5) Un nodo overhand viene fatto due volte per chiudere l'incisione. 6) Il filo in eccesso viene tagliato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig04.jpg"> Figura 4. Posizione del pesce durante il prelievo di sangue (A), l'installazione dell'ago di vetro con il capillare siliconico (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig05.jpg"> Figura 5. L'area di aspirazione del prelievo di sangue (A), il sangue prelevato (B) e le fasi di raccolta del sangue (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig06.jpg"> Figura 6. Il pesce a base di sham mostra l'ovodeposizione di uova puntate da freccia bianca (A) e uova fecondate (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig07.jpg"> Figura 7. Aspetto morfologico (A) e anatomico (B) di pesci intatti e gonadectomizzati. Le frecce bianche (pannelli superiori) mostrano il segno chirurgico sui pesci gonadectomizzati. Le frecce nere (pannelli inferiori) mostrano le gonde nei pesci intatti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig08.jpg"> Figura 8. Segni chirurgici nei pesci maschi e femmine dopo 4 settimane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig09.jpg"> Figura 9. Livelli ematici di E2 nella femmina (A) e 11-KT nel medaka giapponese maschile (B), 24 ore dopo l'operazione fittizia (controllo), in parte gonadectomia o gonadectomia, e 4 mesi dopo gonadectomia (OVX, ovariectomia nelle femmine; Cas, orchidectomia nei maschi). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando One Way ANOVA seguito dal test Tukey Post Hoc. Lettere diverse (a-c) mostrano differenze significative(p-value < 0,05). I dati nel grafico sono forniti come media + SD, n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62006/62006fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Livelli E2 (Femmine)</td>
			<td>Livelli di 11-KT (Maschi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gestito da Sham</td>
			<td>4,15 ± 0,5 (n = 5)</td>
			<td>10,38 ± 1,32 (n = 5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parzialmente gonadectomizzato</td>
			<td>3,37 ± 0,6 (n = 5)</td>
			<td>8,37 ± 1,92 (n = 5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-gonadectomia 24h</td>
			<td>0,36 ± 0,2 (n = 5)</td>
			<td>0,4 ± 0,2 (n = 5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mesi post-gonadectomia</td>
			<td>0,54 ± 0,28 (n = 5)</td>
			<td>0,74 ± 0,22 (n = 5)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Livelli di E2 e 11-KT (ng/mL) nelle femmine e nei maschi di pesci operati da sham e gonadectomizzati e parzialmente gonadectomizzati.

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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale.

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K Views.  Norwegian University of Life Sciences. L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale. 

Video: Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Biologia

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedura di iniezione di spermatidi rotondi murini per studiare lo sviluppo embrionale

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Iniezione di spermatide rotondo di topo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Monitoraggio non invasivo della dimensione della lesione in un modello murino eterologo di endometriosi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Tecniche riproduttive per il monitoraggio e il controllo ovarico negli anfibi

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Il trattamento di droga e

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

Monitoraggio non invasivo della dimensione della lesione in un modello murino eterologo di endometriosi

Tecniche riproduttive per il monitoraggio e il controllo ovarico negli anfibi