Gli autori ringraziano la signora Lourdes Carreon G Tan per la sua assistenza nella zootecnia. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU, Grants-in-Aid from Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant number 18H04881 e 18K19323), e grant for Basic Science Research Projects dalla Sumitomo Foundation a S.K.

Tutte le sperimentazioni e la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le raccomandazioni sul benessere animale sperimentale presso l'Università norvegese di scienze della vita. Gli esperimenti con gonadectomia sono stati approvati dall'Autorità norvegese per la sicurezza alimentare (FOTS ID 24305).
NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando medaka giapponesi maschi e femmine adulti (6-7 mesi, peso circa 0,35 g, lunghezza circa 2,7 cm). Il sesso è stato determinato distinguendo le caratteristiche sessuali secondarie, come la dimensione e la forma della pinna dorsale e anale, come descritto in42,47.
1. Preparazione di strumenti e soluzioni
<ol><li>Preparare la soluzione stock anestetica (0,6% di tricaina).<ol>
<li>Diluire 0,6 g di tricaina (MS-222) in 100 mL di 10x soluzione salina tampone fosfato (PBS).</li>
		<li>Distribuire 1 mL della soluzione stock di Tricaina in diversi tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 °C fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare l'acqua di recupero (soluzione di NaCl 0,9%) aggiungendo 18 g di NaCl in 2 L di acqua dell'acquario. Conservare la soluzione a temperatura ambiente fino all'uso.</li>
	<li>Preparare gli strumenti di incisione rompendo un rasoio in diagonale per ottenere un punto acuto (Figura 1A).</li>
	<li>Preparare una soluzione anticoagulante nel sangue (0,05 U/μL di eparina sodica) diluendo 25 μL di eparina sodica in 500 μL di 1x PBS. Conservare la soluzione anticoagulante a 4 °C fino all'uso.</li>
	<li>Preparare due aghi di vetro da un capillare di vetro lungo 90 mm tirando un capillare di vetro con un estrattore di aghi (Figura 1B) seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: il diametro esterno dell'ago di vetro è di 1 mm, mentre il diametro interno è di 0,6 mm.</li>
	<li>Preparare un coperchio del tubo di plastica da 1,5 ml tagliando il coperchio e praticare un foro che si adatti al diametro esterno dell'ago (Figura 1C). Per fare il foro, riscaldare un'estremità del capillare di vetro da 9 mm e pugnalare il capillare di vetro riscaldato attraverso il coperchio. In alternativa, utilizzare un ago per pugnalare il coperchio fino a quando il diametro del foro si adatta al capillare di vetro da 9 mm.</li>
</ol>2. Procedura di gonadectomia
<ol><li>Preparare lo 0,02% di soluzione anestetica diluendo un tubo di brodo di tricaina (0,6%) in 30 ml di acqua dell'acquario.</li>
	<li>Preparare strumenti di dissezione tra cui una pinza ultra-fine e due sottili (una con punta relativamente larga), piccole forbici, filo di nylon e rasoio come descritto al punto 1.3.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce mettendolo nella soluzione anestetica allo 0,02% per 30-60 secondi. NOTA: La durata dell'anestesia dipende dalle dimensioni e dal peso del pesce e deve essere adattata. Per garantire che il pesce sia completamente anestetizzato, il corpo del pesce può essere pizzicato delicatamente usando una pinza. Se il pesce non reagisce, la gonadectomia può essere avviata.</li>
	<li>Esponi il pesce dalla soluzione anestetica e posiziona il pesce orizzontalmente su un lato, fuori dall'acqua sotto un microscopio di dissezione.</li>
	<li>Ovariectomia (OVX) nelle femmine<ol>
<li>Rimuovere le uova ovopositate (uova appese all'esterno del corpo femminile) se presenti e raschiare le squame nell'area dell'incisione (Figura 2A).</li>
		<li>Fare delicatamente un'incisione lunga circa 2-2,5 mm tra le costole, tra le pinne pelvica e anale (Figura 2A), usando la lama del rasoio. Quindi, pizzicare delicatamente l'addome del pesce mentre si esano le ovaie a poco a poco usando una pinna fine con punta larga.</li>
		<li>Tagliare l'estremità delle ovaie usando una pinna fine e mettere da parte le ovaie (Figura 2B). NOTA: Fare attenzione a non rompere il sacco ovarico, se possibile. Se il sacco ovarico è rotto, rimuovere eventuali tracce di gonne il più completamente possibile senza lasciare nemmeno uova non ovulate.</li>
	</ol></li>
	<li>Orchidectomia nei maschi<ol>
<li>Fare delicatamente un'incisione tra le costole sopra l'ano (Figura 2A) e aprire lentamente l'incisione usando una pinica fine.</li>
		<li>Afferrare delicatamente i testicoli usando la pincitta fine e lentamente togliere i testicoli. Successivamente, tagliare l'estremità dei testicoli per rimuovere completamente i testicoli (Figura 2B). Per l'orchidectomia maschile, tutti i preparati sono simili alle femmine fino alla parte di incisione. Quando si afferrano i testicoli, a volte si ottiene il grasso simile ai testicoli. Tuttavia, dopo aver ripristinato il grasso, è possibile provare a trovare nuovamente i testicoli (Figura 2B). NOTA: Sia per i maschi che per le femmine, è importante ridurre al minimo la dimensione dell'incisione nell'addome per prevenire danni eccessivi che possono portare alla mortalità. A volte l'intestino può anche apparire attraverso l'incisione insieme alle gondi, quindi assicurati che siano correttamente restituite all'interno dell'incisione prima della chiusura. È essenziale una conoscenza preliminare della posizione delle ovaie e dei testicoli nell'addome medaka.</li>
	</ol></li>
	<li>Suturare l'incisione in modo simile nei maschi e nelle femmine (Figura 3).<ol>
<li>Posizionare il filo di nylon accanto all'area dell'incisione e pugnalare la pelle dal lato destro dell'incisione attraverso la cavità interna del corpo usando una pinza ultra-fine per inserire il filo con una pinza fine (Figura 3; 1-2).</li>
		<li>Pugnalare la pelle dal lato sinistro dell'incisione attraverso la cavità esterna del corpo per eliminare il filo ( Figura 3; 3-4).</li>
		<li>Chiudere l'apertura dell'incisione e fare due nodi e tagliare il filo in eccesso (Figura 3; 4-6). NOTA: la sutura deve essere adeguatamente stretta e il filo rimanente sul pesce deve essere abbastanza lungo da impedire l'allentamento della sutura. L'intera procedura dall'anestesia fino alla sutura richiede comunemente fino a 6 minuti. Un tempo più lungo può portare alla mortalità.</li>
		<li>Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. NOTA: i pesci gonadectomizzati di solito mostrano un comportamento normale dopo 1-2 ore nell'acqua di recupero. Pertanto, a seconda dello scopo dell'esperimento, è possibile campionare il pesce dopo questo intervallo di tempo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedura di prelievo del sangue
<ol><li>Preparare gli strumenti: un ago di vetro, un capillare in silicone, un tubo di plastica con un foro, un tubo di plastica vuoto da 1,5 ml, un minicentrifuga e nastro.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce con una soluzione anestetica allo 0,02% come descritto nel passaggio 2.1 e posizionare il pesce sotto un microscopio di dissezione in posizione verticale (Figura 4A). Posizionare il pesce su una superficie luminosa per facilitare la visualizzazione della vena caudale di puntura.</li>
	<li>Installare il cassetto del sangue attaccando un ago di vetro al capillare in silicone (Figura 4B). Rompere la punta dell'ago con una pinna a punta larga e rivestire l'interno dell'ago con una soluzione anticoagulante aspirando e soffiando. NOTA: L'uso di una ventosa e di un capillare in silicone con almeno 50 cm di lunghezza sono raccomandati per le misure di sicurezza per evitare qualsiasi contatto diretto del sangue durante l'aspirazione. Inoltre, assicurarsi che l'apertura della punta dell'ago sia sufficientemente grande da consentire il prelievo del sangue.</li>
	<li>Dirigere l'ago verso l'area del peduncolo del pesce, mirare alla vena del peduncolo caudale (Figura 5A) e prelevare il sangue usando la bocca fino a riempire almeno un quarto del volume totale dell'ago (Figura 5B). NOTA: È importante interrompere l'aspirazione prima di rimuovere l'ago dal corpo del pesce.</li>
	<li>Rilasciare l'ago e mettere un pezzo di nastro in prossimità del lato affilato dell'ago. Posizionare il coperchio con un foro su un tubo di raccolta e mettere l'ago all'interno del tubo attraverso il foro con la punta dell'ago all'esterno (Figura 5C).</li>
	<li>Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. NOTA: Per eseguire un secondo prelievo di sangue dallo stesso pesce, campionare il sangue una settimana dopo il primo prelievo di sangue.</li>
	<li>Flash spin down il sangue raccolto per 1-2 secondi con 1.000 x g a temperatura ambiente per raccogliere il sangue nel tubo.</li>
	<li>Procedere direttamente alle applicazioni a valle o conservare il sangue a -20 °C fino all'uso. NOTA: Fare riferimento allo studio precedente per l'estrazione di steroidi sessuali dal sangue intero48.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come riportato nella letteratura precedente, la gonadectomia e il prelievo di sangue sono stati a lungo utilizzati in altre specie modello per indagare domande relative al ruolo degli steroidi sessuali nella regolazione dell'asse BPG. Tuttavia, queste tecniche sembrano essere suscettibili solo per gli animali più grandi. Considerando le piccole dimensioni del modello di teleosteo comunemente usato, il medaka giapponese, forniamo un protocollo dettagliato per la gonadectomia e il prelievo di sangue che è fattibile per q...

Nei vertebrati, gli steroidi sessuali, che sono prodotti principalmente dalle gonadi, svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'asse cervello-ipofisi-gonadi (BPG) attraverso vari meccanismi di feedback1,2,3,4,5. Inoltre, gli steroidi sessuali influenzano la proliferazione e l'attività dei neuroni nel cervello6,7,8 e le cellule endocrine, compresi i gonadotropi, nell'ipofisi9,10e quindi svolgono ruoli cruciali nel cervello e nella plasticità ipofisaria. Nonostante le conoscenze relativamente buone nei mammiferi, il meccanismo di regolazione dell'asse BPG mediato dagli steroidi sessuali è ben lungi dall'essere compreso nelle specie non mammifere, portando a una scarsa comprensione dei principi evolutivi conservati11. C'è ancora un numero limitato di studi che documentano il ruolo degli steroidi sessuali sul cervello e sulla plasticità ipofisaria, aumentando così la necessità di ulteriori indagini sul ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali su diverse specie di vertebrati.
Tra i vertebrati, i teleostei sono diventati potenti animali modello nell'affrontare numerose domande biologiche e fisiologiche, tra cui la risposta allo stress12,13,la crescita 14,15,la fisiologia nutrizionale16,17 e la riproduzione2. I teleostei, in cui gli steroidi sessuali sono per lo più rappresentati da estradiolo (E2) nelle femmine e 11-chetotestosterone (11-KT) nei maschi18,19, sono stati a lungo modelli sperimentali affidabili per indagare il principio generale della riproduzione tra le specie. I teleostei mostrano unicità nella loro connessione ipotalamo-ipofisaria20,21 e distinte cellule gonadotrope22, che a volte sono convenienti per la delucidazione dei meccanismi di regolazione. Inoltre, grazie alla loro suscettibilità sia agli esperimenti di laboratorio che a quello sul campo, i teleostei offrono molti vantaggi rispetto ad altri organismi. Sono relativamente poco costosi da acquistare e mantenere23,24. In particolare, piccoli modelli di teleostei come il pesce zebra (Danio rerio) e il giapponese medaka (Oryzias latipes), sono specie con una fecondità molto elevata e un ciclo di vita relativamente breve che consente una rapida analisi della funzione genica e dei meccanismi di malattia23, fornendo così vantaggi ancora maggiori nell'affrontare una pletora di questioni biologiche e fisiologiche, considerando i numerosi protocolli ben sviluppati e toolkit genetici disponibili per queste specie25.
In numerosi studi, la rimozione delle gonidi (gonadectomia) insieme alle tecniche di prelievo del sangue sono state utilizzate come metodo per indagare molte questioni fisiologiche, incluso il suo impatto nella fisiologia riproduttiva dei vertebrati nei mammiferi26,27,28,uccelli29 e anfibi30. Sebbene l'effetto della gonadectomia sulla fisiologia riproduttiva possa essere alternativamente imitato da antagonisti degli steroidi sessuali, come il tamoxifene e il clomifene, l'effetto dei farmaci sembra essere incoerente a causa degli effetti bimodali31,32. L'esposizione cronica a un antagonista steroideo sessuale può portare all'allargamentoovarico33,34, che può disabilitare l'osservazione dei suoi effetti a lungo termine a causa di un fenotipo malsano. Inoltre, è impossibile eseguire un esperimento di recupero dopo il trattamento con antagonisti degli steroidi sessuali, per garantire l'effetto specifico di alcuni steroidi sessuali. Insieme a questi punti di cui sopra, altri compromessi dell'uso di antagonisti di steroidi sessuali sono stati ampiamente rivisti31,32. Pertanto, la gonadectomia appare ancora oggi come una potente tecnica per indagare il ruolo degli steroidi sessuali.
Mentre la gonadectomia e le tecniche di prelievo del sangue sono relativamente facili da eseguire in specie più grandi, come il branzino europeo (Dicentrarchus labrax)35, il labbro blu (Thalassoma bifasciatum)36, il pesce cane (Scyliorhinus canicula)37 e il pesce gatto (Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)38,39, sollevano sfide quando applicati in piccoli pesci come medaka. Ad esempio, l'uso del Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 è meno fattibile e sembra essere soggetto a danni fisici eccessivi per i piccoli pesci. Inoltre, una procedura di gonadectomia comunemente usata per i pesci più grandi40 non è adatta per i pesci piccoli che richiedono un'elevata precisione per evitare danni eccessivi. Infine, il prelievo di sangue è impegnativo a causa dell'accesso limitato ai vasi sanguigni e della piccola quantità di sangue in quegli animali. Pertanto, un protocollo chiaro che dimostri ogni fase della gonadectomia e del prelievo di sangue in un piccolo teleosteo è importante.
Questo protocollo dimostra le procedure passo-passo della gonadectomia seguite dal prelievo di sangue nel medaka giapponese, un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia orientale. I medaka giapponesi hanno un genoma sequenziato, diversi strumenti molecolari e genetici disponibili25e un sistema di determinazione genetica del sesso che consente di esaminare le differenze sessuali prima che le caratteristiche sessuali secondarie o le gonde siano ben sviluppate41. È interessante notare che i medaka giapponesi possiedono gondi fuse contrariamente a molte altre specie di teleostei42. Queste due tecniche combinate richiedono solo 8 minuti in totale e completeranno l'elenco dei protocolli video già esistenti per questa specie che includeva l'etichettatura dei vasi sanguigni43, patch-clamp sulle sezioni ipofisarie44 e neuroni cerebrali45e la coltura cellulare primaria46. Queste tecniche consentiranno alla comunità di ricerca di indagare e comprendere meglio i ruoli degli steroidi sessuali nei meccanismi di feedback, nonché la plasticità cerebrale e ipofisaria in futuro.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Gli steroidi sessuali, prodotti dalle gonidi, svolgono un ruolo essenziale nella plasticità del cervello e del tessuto ipofisario e nel controllo neuroendocrino della riproduzione in tutti i vertebrati fornendo feedback al cervello e all'ipofisi. I pesci teleostei possiedono un più alto grado di plasticità tissutale e variazione nelle strategie riproduttive rispetto ai mammiferi e sembrano essere modelli utili per indagare il ruolo degli steroidi sessuali e i meccanismi con cui agiscono. La rimozione della principale fonte di produzione di steroidi sessuali utilizzando la gonadectomia insieme al prelievo di sangue per misurare i livelli di steroidi è stata ben consolidata e abbastanza fattibile nei pesci più grandi ed è una tecnica potente per indagare il ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali. Tuttavia, queste tecniche sollevano sfide se implementate in modelli di teleostei di piccole dimensioni. Qui, descriviamo le procedure passo-passo della gonadectomia sia nei maschi che nelle femmine di medaka giapponese seguite da prelievo di sangue. Questi protocolli si sono dimostrati altamente fattibili in medaka indicato da un alto tasso di sopravvivenza, sicurezza per la durata della vita e fenotipo del pesce e riproducibilità in termini di clearance degli steroidi sessuali. L'uso di queste procedure combinato con gli altri vantaggi dell'utilizzo di questo piccolo modello di teleosteo migliorerà notevolmente la comprensione dei meccanismi di feedback nel controllo neuroendocrino della riproduzione e della plasticità tissutale fornita dagli steroidi sessuali nei vertebrati.

Questo protocollo descrive ogni fase per l'esecuzione della gonadectomia e del prelievo di sangue in un teleosteo modello di piccole dimensioni, il medaka giapponese. Il tasso di sopravvivenza del pesce dopo ovariectomia (OVX) nelle femmine è del 100% (10 su 10 pesci) mentre il 94% (17 su 18 pesci) dei maschi è sopravvissuto dopo orchidectomia. Nel frattempo, dopo che è stata eseguita la procedura di prelievo del sangue, tutti i pesci (38 pesci) sono sopravvissuti.
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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale.

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K Views.  Norwegian University of Life Sciences. L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale. 

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

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Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

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Biologia

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedura migliorata per ottenere ovociti di zebrafish di stadio I privi di cellule della granulosa

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model organism to investigate early developmental processes from oocyte to embryo. In zebrafish, oocytes are surrounded by a single layer of somatic granulosa cells. However, separating granulosa cells from oocytes poses a challenge, as achieving pure oocytes is crucial for precise analysis. Although various methods have been proposed to isolate zebrafish oocytes at different developmental stages, current techniques fall short in removing granulosa cells completely, limiting the accuracy of genome analysis focused solely on oocytes. In this study, we successfully developed a rapid and efficient process for isolating pure stage I oocytes in zebrafish while eliminating granulosa cell contamination. This technique facilitates biochemical and molecular analysis, particularly in exploring epigenetic and genome structure aspects specific to oocytes. Notably, the method is user-friendly, minimizes oocyte damage, and provides a practical solution for subsequent research and analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Metodo avanzato per isolare gli ovociti puri di Zebrafish Stage I

This protocol describes a modified procedure for rapidly isolating clean stage I oocytes in zebrafish devoid of granulosa cells, thereby providing a convenient method for oocyte-specific research.

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Monitoraggio non invasivo della dimensione della lesione in un modello murino eterologo di endometriosi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Riepilogo

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Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

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