Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
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Os autores agradecem à Sra. Lourdes Carreon G Tan por sua ajuda na criação de peixes. Este trabalho foi financiado pela NMBU, Grants-in-Aid da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant number 18H04881 e 18K19323), e bolsa para Projetos básicos de Pesquisa científica da Fundação Sumitomo para S.K.

Todas as experimentações e manejo animal foram conduzidas de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental na Universidade Norueguesa de Ciências da Vida. Os experimentos com a gonadectomia foram aprovados pela Autoridade Norueguesa de Segurança Alimentar (FOTS ID 24305).
NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando-se medaka adulto masculino e feminino (6-7 meses de idade, peso de 0,35 g, comprimento de 2,7 cm) medaka japonês. O sexo foi determinado por distinguir as características sexuais secundárias, como o tamanho e a forma da barbatana dorsal e anal, conforme descrito em42,47.
1. Preparação de instrumentos e soluções
<ol><li>Prepare a solução de estoque anestésico (0,6% Tricaine).<ol>
<li>Diluir 0,6 g de Tricaine (MS-222) em 100 mL de 10x Phosphate Buffer Saline (PBS).</li>
		<li>Distribua 1 mL da solução de estoque tricaine em vários tubos plásticos de 1,5 mL e armazene a -20 °C até usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a água de recuperação (solução nacl de 0,9%) adicionando 18 g de NaCl em 2 L de água de aquário. Armazene a solução em temperatura ambiente até o uso.</li>
	<li>Prepare as ferramentas de incisão quebrando uma navalha na diagonal para obter um ponto afiado(Figura 1A).</li>
	<li>Prepare a solução anticogulante sanguínea (0,05 U/μL de heparina de sódio) diluindo 25 μL de heparina de sódio em 500 μL de 1x PBS. Armazene a solução anticopante a 4 °C até usar.</li>
	<li>Prepare duas agulhas de vidro de um capilar de vidro de 90 mm de comprimento puxando um capilar de vidro com um puxador de agulha(Figura 1B) seguindo as instruções do fabricante. NOTA: O diâmetro externo da agulha de vidro é de 1 mm, enquanto o diâmetro interno é de 0,6 mm.</li>
	<li>Prepare uma tampa de tubo plástico de 1,5 mL cortando a tampa e faça um orifício que se encaixe com o diâmetro externo da agulha(Figura 1C). Para fazer o orifício, aqueça uma extremidade do capilar de vidro de 9 mm e esfaqueie o capilar de vidro aquecido através da tampa. Alternativamente, use uma agulha para furar a tampa até que o diâmetro do orifício se encaixe com o capilar de vidro de 9 mm.</li>
</ol>2. Procedimento de gonadectomia
<ol><li>Prepare 0,02% da solução anestésico diluindo um tubo de estoque tricaine (0,6%) em 30 mL de água do aquário.</li>
	<li>Prepare ferramentas de dissecção, incluindo um ultra-fino e dois fórceps finos (um com ponta relativamente larga), tesoura pequena, fio de nylon e navalha como descrito na etapa 1.3.</li>
	<li>Anestesiar o peixe colocando-o na solução anestésico de 0,02% por 30-60 segundos. NOTA: A duração da anestesia depende do tamanho e peso do peixe e deve ser adaptada. Para garantir que o peixe esteja totalmente anestesiado, o corpo do peixe pode ser perfeitamente beliscado usando fórceps. Se o peixe não reagir, a gonadectomia pode ser iniciada.</li>
	<li>Retire o peixe da solução anestésico e coloque o peixe horizontalmente de lado, fora d'água sob um microscópio de dissecção.</li>
	<li>Ovaectomia (OVX) em fêmeas<ol>
<li>Remova os ovos ovipositados (ovos pendurados fora do corpo feminino) se houver e raspe as escamas na área de incisão(Figura 2A).</li>
		<li>Faça delicadamente uma incisão de cerca de 2-2,5 mm de comprimento entre as costelas, entre as aletas pélvicas e anais(Figura 2A),utilizando a lâmina de barbear. Em seguida, belisque suavemente o abdômen do peixe enquanto tira os ovários pouco a pouco usando fórceps finos com ponta larga.</li>
		<li>Corte a extremidade dos ovários usando fórceps finos e coloque os ovários de lado(Figura 2B). NOTA: Tome cuidado para não quebrar o saco ovariano, se possível. Se o saco ovariano estiver quebrado, remova qualquer traço de gônada o mais completamente possível sem deixar nenhum óvulo não ovulado.</li>
	</ol></li>
	<li>Orquídea em machos<ol>
<li>Faça suavemente uma incisão entre as costelas acima do ânus(Figura 2A),e abra a incisão lentamente usando fórceps finos.</li>
		<li>Pegue suavemente os testículos usando os fórceps finos e lentamente retire os testículos. Depois, corte a extremidade dos testículos para remover completamente os testículos(Figura 2B). Para orquídeas machos, todas as preparações são semelhantes às das fêmeas até a parte da incisão. Ao pegar os testículos, às vezes a gordura que se assemelha aos testículos é obtida. No entanto, após a restauração da gordura, é possível tentar encontrar os testículos novamente(Figura 2B). NOTA: Tanto para homens quanto para fêmeas, é importante minimizar o tamanho da incisão no abdômen para evitar danos excessivos que possam levar à mortalidade. Às vezes, os intestinos também podem aparecer através da incisão junto com as gônadas, por isso certifique-se de que elas sejam devidamente devolvidas dentro da incisão antes do fechamento. O conhecimento prévio sobre ovários e localização de testículos no abdômen medaka é essencial.</li>
	</ol></li>
	<li>Sutura a incisão da mesma forma em machos e fêmeas(Figura 3).<ol>
<li>Coloque a linha de nylon ao lado da área de incisão e esfaqueie a pele do lado direito da incisão através da cavidade interna do corpo usando fórceps ultrafinas para levar o fio com fórceps finos(Figura 3; 1-2).</li>
		<li>Apunhale a pele do lado esquerdo da incisão através da cavidade externa do corpo para tirar a rosca ( Figura 3; 3-4).</li>
		<li>Feche a abertura da incisão e faça dois nós e corte a rosca excessiva(Figura 3; 4-6). NOTA: A sutura deve estar adequadamente apertada, e o restante do fio do peixe deve ser longo o suficiente para evitar o afrouxamento da sutura. Todo o procedimento desde anestesia até a sutura geralmente leva até 6 minutos. Tempo mais longo pode levar à mortalidade.</li>
		<li>Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário. NOTA: Peixes gonadectomizados geralmente apresentam comportamento normal após 1-2 horas na água de recuperação. Portanto, dependendo do propósito do experimento, pode-se provar o peixe após esse intervalo de tempo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedimento de amostragem de sangue
<ol><li>Prepare as ferramentas: uma agulha de vidro, um capilar de silicone, um tubo de plástico com um orifício, um tubo plástico vazio de 1,5 mL, uma minicentrifuagem e fita.</li>
	<li>Anestesiar o peixe utilizando solução anestésico de 0,02%, conforme descrito na etapa 2.1 e colocar o peixe sob um microscópio de dissecção em posição vertical(Figura 4A). Coloque o peixe em uma superfície brilhante para facilitar a visualização da veia de punção caudal.</li>
	<li>Instale a gaveta de sangue anexando uma agulha de vidro ao capilar de silicone(Figura 4B). Quebre a ponta da agulha com adoçam de ponta larga e cubra o interior da agulha com solução anticogulante por sucção e sopro. NOTA: Recomenda-se o uso de um e um capilar de silicone com pelo menos 50 cm de comprimento para medidas de segurança para evitar qualquer contato direto do sangue ao sucumbir. Além disso, certifique-se de que a abertura da ponta da agulha é suficientemente grande para permitir o desenho do sangue.</li>
	<li>Direcione a agulha em direção à área do pedículo do peixe, aponte para a veia peduncle caudal(Figura 5A) e tire o sangue usando a boca até pelo menos um quarto o volume total da agulha é preenchido(Figura 5B). NOTA: É importante parar de aspirar antes de remover a agulha do corpo do peixe.</li>
	<li>Solte a agulha e coloque um pedaço de fita na proximidade do lado afiado da agulha. Coloque a tampa com um orifício em um tubo de coleta e coloque a agulha dentro do tubo através do orifício com a ponta da agulha por fora(Figura 5C).</li>
	<li>Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário. NOTA: Para realizar uma segunda amostragem de sangue do mesmo peixe, prove o sangue uma semana após a primeira amostragem de sangue.</li>
	<li>Gire o sangue coletado por 1-2 segundos com 1.000 x g à temperatura ambiente para coletar o sangue no tubo.</li>
	<li>Proceda diretamente para aplicações a jusante ou armazene o sangue a -20 °C até o uso. NOTA: Consulte o estudo anterior para extração de esteroides sexuais de todo o sangue48.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como relatado na literatura anterior, a gonadectomia e a amostragem de sangue têm sido utilizadas há muito tempo em outras espécies modelo para investigar questões relacionadas ao papel dos esteroides sexuais na regulação do eixo BPG. No entanto, essas técnicas parecem ser favoráveis apenas para animais maiores. Considerando o pequeno tamanho do modelo teleost comumente usado, medaka japonês, fornecemos um protocolo detalhado para gonadectomia e amostragem de sangue que é viável para esta espécie.
<p clas...

Em vertebrados, os esteroides sexuais, que são produzidos principalmente pelas gôndas, desempenham papéis importantes na regulação do eixo Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) através de vários mecanismos de feedback1,2,3,4,5. Além disso, os esteroides sexuais afetam a proliferação e a atividade de neurônios no cérebro6,7,8 e células endócrinas, incluindo gonadotropes, na pituitária9,10, e assim servem papéis cruciais na plasticidade cerebral e pituitária. Apesar do conhecimento relativamente bom em mamíferos, o mecanismo de regulação do eixo BPG mediado por esteroides sexuais está longe de ser compreendido em espécies não-mamíferas, levando à má compreensão dos princípios evolutivos conservados11. Ainda há um número limitado de estudos documentando o papel dos esteroides sexuais na plasticidade cerebral e pituitária, aumentando assim a necessidade de investigações adicionais sobre o papel e os efeitos dos esteroides sexuais em diversas espécies de vertebrados.
Entre os vertebrados, as teleostas tornaram-se animais modelo poderosos no enfrentamento de inúmeras questões biológicas e fisiológicas, incluindo resposta ao estresse12,13, crescimento14,15, fisiologia nutricional16,17 e reprodução2. Teleosts, nos quais os esteroides sexuais são representados principalmente por estradiol (E2) em fêmeas e 11-cetosetosterona (11-KT) em machos18,19, têm sido modelos experimentais confiáveis para investigar o princípio geral da reprodução entre espécies. As teleóstas mostram singularidade em sua conexão hipotalâmica-pituitária20,21 e distintas células gonadotrope22, que às vezes são convenientes para a elucidação de mecanismos regulatórios. Além disso, devido à sua comodidade tanto para experimentos de laboratório quanto de campo, os teleosts oferecem muitas vantagens em comparação com outros organismos. Eles são relativamente baratos para comprar e manter23,24. Em particular, pequenos modelos de teleost como o zebrafish (Danio rerio) e o medaka japonês (Oryzias latipes), são espécies com fecundidade muito alta e um ciclo de vida relativamente curto, permitindo a análise rápida da função genética e mecanismos de doença23, proporcionando assim vantagens ainda maiores no enfrentamento de uma infinidade de questões biológicas e fisiológicas, considerando os inúmeros protocolos bem desenvolvidos e kit de ferramentas genéticas disponíveis para essas espécies25.
Em inúmeros estudos, a remoção de gônadas (gonadectomia) juntamente com técnicas de amostragem de sangue têm sido utilizadas como método para investigar muitas questões fisiológicas, incluindo seu impacto na fisiologia reprodutiva de vertebrados nos mamíferos26,27,28, aves29 e anfíbios30. Embora o efeito gonadectomia na fisiologia reprodutiva possa ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuais, como tamoxifen e clomifeno, o efeito das drogas parece ser inconsistente devido aos efeitos bimodais31,32. A exposição crônica a um antagonista de esteroides sexuais pode levar ao alargamento ovariano33,34, que pode desativar a observação de seus efeitos para fins de longo prazo devido a um fenótipo não saudável. Além disso, é impossível realizar um experimento de recuperação após o tratamento antagonista de esteroides sexuais, para justificar o efeito específico de certos esteroides sexuais. Junto com esses pontos acima mencionados, outras trocas de uso de antagonistas de esteroides sexuais foram amplamente revisadas31,32. Portanto, a gonadectomia ainda aparece hoje como uma técnica poderosa para investigar o papel dos esteroides sexuais.
Enquanto as técnicas de gonadectomia e amostragem de sangue são relativamente fáceis de executar em espécies maiores, como o robalo europeu (Dicentrarchus labrax)35, o tálamo azul(Thalassoma bifasciatum)36, o dogfish(Scyliorhinus canicula)37 e o bagre(Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)38,39, eles levantam desafios quando aplicados em peixes pequenos como medaka. Por exemplo, o uso do Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 é menos viável e parece ser propenso a danos físicos excessivos para peixes pequenos. Além disso, um procedimento de gonadectomia que é comumente usado para peixes maiores40 não é adequado para peixes pequenos que requer alta precisão para evitar danos excessivos. Finalmente, a amostragem de sangue é desafiadora devido ao acesso limitado aos vasos sanguíneos e à pequena quantidade de sangue nesses animais. Portanto, um protocolo claro demonstrando cada passo de gonadectomia e amostragem de sangue em um pequeno teleost é importante.
Este protocolo demonstra os procedimentos passo a passo da gonadectomia seguidos pela amostragem de sangue em medaka japonesa, um pequeno peixe de água doce nativo do leste da Ásia. Medaka japonesa tem um genoma sequenciado, várias ferramentas moleculares e genéticas disponíveis25, e um sistema de determinação genética de sexo que permite a investigação de diferenças sexuais antes que características sexuais secundárias ou gônadas sejam bem desenvolvidas41. Curiosamente, medaka japonesa possui gônadas fundidas contrárias a muitas outras espécies de teleost42. Essas duas técnicas combinadas levam apenas 8 minutos no total e completarão a lista de protocolos de vídeo já existentes para esta espécie que incluía rotulagem de vasos sanguíneos43,grampo de remendo nas seções pituitárias44 e neurônios cerebrais45, e cultura celular primária46. Essas técnicas permitirão que a comunidade de pesquisa investigue e entenda melhor os papéis dos esteroides sexuais em mecanismos de feedback, bem como na plasticidade cerebral e pituitária no futuro.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Os esteroides sexuais, produzidos pelas gôndas, desempenham um papel essencial na plasticidade do cérebro e do tecido pituitário e no controle neuroendócrino da reprodução em todos os vertebrados, fornecendo feedback ao cérebro e à hipófise. Os peixes teleost possuem um maior grau de plasticidade tecidual e variação nas estratégias reprodutivas em comparação com os mamíferos e parecem ser modelos úteis para investigar o papel dos esteroides sexuais e os mecanismos pelos quais atuam. A remoção da principal fonte de produção de esteroides sexuais usando gonadectomia juntamente com amostragem de sangue para medir os níveis de esteroides tem sido bem estabelecida e bastante viável em peixes maiores e é uma técnica poderosa para investigar o papel e os efeitos dos esteroides sexuais. No entanto, essas técnicas levantam desafios quando implementadas em modelos teleost de pequeno porte. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo da gonadectomia em ambos os machos e fêmeas medaka japonesa seguidos de amostragem de sangue. Estes protocolos são mostrados altamente viáveis em medaka indicado por uma alta taxa de sobrevivência, segurança para o tempo de vida e fenótipo do peixe, e reprodutibilidade em termos de liberação de esteroides sexuais. O uso desses procedimentos combinados com as outras vantagens do uso deste pequeno modelo teleost melhorará muito a compreensão dos mecanismos de feedback no controle neuroendócrino da reprodução e plasticidade tecidual proporcionada por esteroides sexuais em vertebrados.

Este protocolo descreve cada passo para a realização de gândectomia e amostragem de sangue em um teleost modelo de pequeno tamanho, o medaka japonês. A taxa de sobrevivência dos peixes após a ovariectomia (OVX) nas fêmeas é de 100% (10 em cada 10 peixes), enquanto 94% (17 dos 18 peixes) dos machos sobreviveram após orquídea. Enquanto isso, após a realização do procedimento de amostragem de sangue, todos os peixes (38 peixes) sobreviveram.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal.

Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K visualizações.  Norwegian University of Life Sciences. O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal. 

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Biologia do Desenvolvimento

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Biologia

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimento de injeção de espermátides redondas murinas para estudar o desenvolvimento embrionário

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Injeção de espermátide redonda em camundongo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

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Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Monitorização não invasiva do tamanho da lesão em um modelo de Mouse heteróloga de endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Técnicas reprodutivas para monitoramento e controle ovariano em anfíbios

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Resumo

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dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

Tratamento de drogas e

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

Monitorização não invasiva do tamanho da lesão em um modelo de Mouse heteróloga de endometriose

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