Les poissons-zèbres offrent un modèle de régénération neuronale précieux en raison de leur capacité à se remettre d’une lésion de la moelle épinière. Cette méthode décrit l’endurance à la nage et le comportement de nage comme des lectures de la réparation fonctionnelle de la moelle épinière. Cette technique fournit une évaluation fiable et quantifiable de l’endurance à la nage et du comportement de nage chez le poisson-zèbre adulte.
Ces méthodes sont également applicables aux études du développement neuromusculaire et musculo-squelettique, de la maladie et de la régénération. Pour évaluer l’endurance à nager, ouvrez le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement. Cliquez sur la case intitulée Expérience et décochez Uswim et Uwater.
Ensuite, modifiez la vitesse d’écoulement dans la boîte uwater en bas à gauche pour ajuster les vitesses du courant d’eau. Pour commencer un protocole automatisé, cliquez sur la case Démarrer la journalisation. Dans la fenêtre de dialogue qui s’ouvre, choisissez Automatisé dans la liste déroulante.
Pour ouvrir un fichier de protocole précédemment enregistré, cliquez sur l’icône de fichier à côté du fichier de protocole. Ensuite, configurez le fichier de sortie en cliquant sur l’icône du fichier à côté du fichier journal. Dans la fenêtre de l’explorateur de fichiers qui s’ouvre, nommez le fichier de sortie et enregistrez-le à l’emplacement souhaité.
Ensuite, configurez une fenêtre de minuterie fractionnée pour assurer un accès simultané au logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement et aux fenêtres de minuterie sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, installez un aquarium de collecte de poissons pour abriter les poissons épuisés après leur retrait du tunnel de baignade. Remplissez le réservoir de collecte et un long tube de polychlorure de vinyle avec de l’eau du système de poisson zèbre.
Placez une extrémité du tube prérempli dans le réservoir de collecte et une autre dans le réservoir tampon, en veillant à ce que l’eau puisse s’écouler librement du réservoir tampon dans le réservoir de collecte. Serrez l’extrémité supérieure du tube avec un clip de liant pour empêcher l’écoulement de l’eau et utilisez le clip de liant pour contrôler l’écoulement de l’eau au besoin. Fermez le tunnel de natation avec le couvercle d’endurance de natation avant de placer un groupe de poissons à l’intérieur du tunnel de natation.
Pour acclimater le poisson au tunnel de nage et à la direction de l’écoulement, démarrez le chronomètre fractionné et ajustez la vitesse actuelle à zéro centimètre par seconde pendant les cinq premières minutes, à neuf centimètres par seconde pendant les cinq minutes suivantes et à 10 centimètres par seconde pendant les cinq minutes suivantes. Après l’acclimatation, ouvrez le protocole et démarrez le programme automatisé de contrôle de la vitesse d’écoulement, qui augmentera la vitesse du courant d’eau de deux centimètres par seconde chaque minute. Surveillez le poisson pour l’épuisement.
Les poissons épuisés seront poussés vers l’arrière du tunnel de baignade. Pour vous assurer qu’un poisson est épuisé, tapotez doucement l’extrémité arrière du tunnel ou créez une ombre sur cette zone pour stimuler le poisson à nager. Les poissons épuisés n’ont pas répondu au stimulus de sursaut et gisaient à plat à l’extrémité arrière du tunnel.
Lorsqu’un poisson est épuisé, désaler le tube de collecte du poisson. Ouvrez la fenêtre du tunnel de nage et ramassez les poissons dans l’aquarium de collecte. Enregistrez le temps à l’épuisement à l’aide du chronomètre fractionné.
Une fois que tous les poissons sont épuisés et collectés dans le réservoir de collecte, cliquez sur le bouton Arrêt d’urgence du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement et arrêtez la minuterie. Pour capturer des films pour le test de comportement de nage, placez un groupe de poissons dans le tunnel de nage et fermez le tunnel à l’aide d’un couvercle standard entièrement fermé. Ensuite, ouvrez une nouvelle fenêtre d’enregistrement et nommez le fichier.
Ne cliquez pas encore sur Enregistrer. Avant de commencer une nouvelle expérience, placez une serviette en papier ou un morceau de tissu sur le côté du tunnel de nage pour vous assurer que tous les comportements sont dus à la nage des poissons et non à une réaction de sursaut causée par un mouvement dans l’environnement. Après vous être assuré que l’eau est calme et qu’aucune ondulation ne se déplace sur le cadre, cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre du logiciel de l’appareil photo pour commencer à enregistrer le fichier vidéo.
Cliquez ensuite sur Démarrer dans le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement pour commencer le protocole, qui se poursuivra sans interruption. Regardez le film pour vous assurer qu’aucune image n’est lâchée, qu’il n’y a pas de bulles dans le champ de vision et que tous les poissons sont enregistrés. Une fois l’enregistrement vidéo terminé, cliquez sur Arrêt d’urgence pour mettre fin au protocole de contrôle de la vitesse d’écoulement et vérifier que le fichier de sortie de données est enregistré automatiquement.
Ensuite, fermez la fenêtre d’enregistrement pour enregistrer le fichier vidéo. Après l’enregistrement, retirez le couvercle. Récupérez soigneusement les poissons et retournez-les dans leur aquarium.
Pour analyser les films capturés, ouvrez le tracking_v2. ijm script aux Fidji et cliquez sur Exécuter pour commencer le programme. Dans la fenêtre contextuelle, choisissez le dossier contenant les films de comportement de natation à suivre et cliquez sur Ouvrir.
Recherchez l’une des images du premier film, une boîte de dialogue et la région d’intérêt, ou gestionnaire de retour sur investissement, qui apparaîtra. Suivez les instructions données dans la boîte de dialogue et créez un retour sur investissement au bas de la chambre du tunnel de nage. Cliquez ensuite sur OK et assurez-vous qu’aucun coin noir n’est vu.
La fenêtre de seuil s’ouvre avec un cadre de seuil modifié. Changez le jeu de couleurs du noir et blanc au rouge et ajustez la valeur maximale jusqu’à ce que la première image n’affiche que le poisson en rouge et rien d’autre. Enregistrez le seuil et cliquez sur OK dans la boîte de dialogue.
Pour aligner, assembler et acquérir des statistiques descriptives, ouvrez le SwimBehavior_v7-3. R script dans RStudio et cliquez sur Source dans le coin supérieur droit de la section script. Dans une nouvelle fenêtre qui s’ouvre, choisissez le dossier contenant le _raw.
csv générés par Fidji et cliquez sur Ouvrir. Le programme s’exécutera automatiquement. Dans la boîte de dialogue contextuelle, confirmez le nombre de poissons dans chaque film.
Cliquez sur Oui si les chiffres donnés sont corrects ou non si les chiffres sont incorrects. Une fois les fichiers alignés, recherchez un _aligned nouvellement généré. fichier csv.
Après vous être assuré que le programme combine les données, exécute des statistiques et trace des graphiques de sortie, recherchez les fichiers d’analyse générés dans un nouveau dossier intitulé Résultats dans le dossier parent contenant les _raw. csv et _aligned. csv.
L’endurance en natation évaluée à deux, quatre et six semaines après la blessure a montré une perte de 60% de la capacité d’endurance en natation à deux semaines. Le poisson régénérant a progressivement retrouvé son endurance à la nage quatre et six semaines après sa blessure. Dans le test de comportement de nage, les commandes nageaient régulièrement dans la partie avant de la chambre du tunnel de nage correspondant à une position Y élevée.
En revanche, deux semaines après la blessure, les poissons blessés ne pouvaient pas maintenir une capacité de nage stable à contre-courant. Par conséquent, leurs pistes de nage sont plus irrégulières, avec une diminution globale de la position Y. La position Y a augmenté quatre et six semaines après la blessure, ce qui indique que les animaux en régénération ont progressivement retrouvé leur capacité à nager.
De plus, par rapport aux témoins non blessés, les animaux blessés deux semaines après la blessure étaient nettement moins actifs, calés dans le quadrant arrière du tunnel de nage et ont perdu leur capacité à nager contre de faibles vitesses de courant. Conformément à leur capacité innée à atteindre une récupération fonctionnelle, les animaux lésés ont progressivement normalisé les paramètres de comportement de nage quatre et six semaines après la blessure. L’utilisation du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement dans ce protocole est facultative.
L’alternative consiste à contrôler manuellement le moteur à courant d’eau. Les tests décrits dans cette étude peuvent être utilisés pour pré-dépister les phénotypes neuronaux, musculaires ou squelettiques. Le tissu d’intérêt peut ensuite être récolté pour un examen histologique ou moléculaire.
Notre laboratoire et d’autres ont utilisé ce protocole pour identifier les gènes nécessaires à la réparation neuronale innée et les facteurs suffisants pour améliorer la régénération neuronale.
