La PCR numérique par gouttelettes offre une précision et une sensibilité accrues par rapport à la PCR quantitative. Il s’agit d’une méthode simple pour la PCR numérique par gouttelettes nécessitant un équipement minimal et aucune expertise. L’émulsification à modèle de particules est une méthode d’émulsification sans microfluidique qui ne nécessite aucun équipement spécialisé.
En outre, l’émulsification se produit sur une période de quelques secondes et s’adapte au volume du conteneur. Pour les billes commerciales, ajoutez 0,5 gramme de particules de polyacrylamide séchées compatibles avec l’émulsification de gabarit de particules, ou PTE, à 30 millilitres d’eau stérile dans un tube conique de 50 millilitres et mélangez bien. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
Pour la fabrication microfluidique de billes, versez un millilitre de résine photosensible sur le centre d’une plaquette de silicium de trois pouces, puis faites-la tourner à 500 tr / min pendant 30 secondes, suivie de 1250 tr / min pendant 30 secondes. Placez la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes pour évaporer le solvant. Fixez le photomasque sur la plaquette de silicium à l’aide d’une lame de verre de couverture et exposez la plaquette sous une LED UV collimée pendant 2,5 minutes.
Placez la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour la cuisson post-exposition. Développez la plaquette de silicium photorésistante en l’immergeant dans un bain de 100% PGMEA pendant 15 minutes. Rincer la plaquette avec du 100% PGMEA frais, suivi de 100% d’isopropanol.
Séchez la plaquette à l’air libre, puis séchez-la sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant une minute et placez-la dans une boîte de Petri propre de trois pouces. Mélangez la base de silicium PDMS et le réactif de durcissement dans un rapport de 10:1, puis dégaz le PDMS mélangé à l’aide d’un dessiccateur sous vide jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air ne soit observable. Versez le PDMS dégazé dans la boîte de Pétri, en veillant à ce que la plaquette de silicium soit complètement immergée.
Dégazez la plaquette de silicium et le PDMS, puis durcissez le PDMS en plaçant la plaquette de silicium dans un four réglé à 65 degrés Celsius pendant au moins 60 minutes. Exciser un bloc de PDMS contenant les caractéristiques microfluidiques de la boîte de Pétri, à l’aide d’un scalpel. Poinçonnez les entrées et les sorties dans le bloc PDMS à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 millimètre.
Ensuite, enlevez la poussière et les particules avec l’application répétitive et le retrait du ruban d’emballage sur la surface du bloc. Nettoyez une lame de verre en la rinçant avec 100% d’isopropanol, puis en séchant la surface à l’air. Plasma traiter à la fois la lame de verre et le PDMS avec un millibar de plasma d’oxygène pendant une minute, à l’aide d’un liant plasma.
Fixez le PDMS sur la lame de verre en plaçant le PDMS traité au plasma avec des caractéristiques orientées vers le bas sur la lame de verre, côté traité au plasma vers le haut. Placez la glissière dans un four réglé à 65 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes, pour terminer le collage. Traiter tous les canaux microfluidiques avec un traitement de surface fluoré pour assurer l’hydrophobicité de surface, puis cuire l’appareil à 65 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.
Chargez à la fois du polyacrylamide, ou PAA, et de l’hydrofluoroéther, ou HFE, des seringues contenant des solutions dans des pompes à seringues. Connectez les deux seringues au dispositif microfluidique à l’aide d’un tube en polyéthylène. Faites fonctionner le dispositif de génération de gouttes et collectez un millilitre des gouttelettes dans un tube de collecte de 15 millilitres, puis incubez pendant trois heures à température ambiante pour la polymérisation.
Après l’incubation, retirez la couche inférieure d’huile par pipetage. Ajouter un millilitre de 20% de PFO dans de l’huile HFE au tube de collecte de 15 millilitres comme désémulsifiant chimique. Après le mélange, faire tourner le tube de collecte de 15 millilitres à 2000 x g, pendant deux minutes.
Retirez la couche inférieure par pipetage et répétez le processus une fois de plus. Ajouter deux millilitres de monooléate de sorbitan à 2 % dans l’hexane au tube de collecte de 15 millilitres et le vortexer. Faire tourner le tube à 3000 x g pendant trois minutes et retirer le surnageant par pipetage pour éliminer la solution tensioactive.
Répétez cette opération deux fois. Ajouter cinq millilitres de tampon TEBST et bien mélanger, puis tourner à 3000 x g pendant trois minutes et retirer le surnageant par pipetage. Répétez cette opération trois fois, puis remettez en suspension cinq millilitres de TEBST.
Préparer les particules de polyacrylamide pour l’émulsification par gabarit de particules en centrifugant à 6000 x g pendant une minute pour granuler les particules. Ensuite, retirez le surnageant par pipetage et remettez la pastille dans de l’eau stérile. Répétez trois fois pour vous assurer de l’élimination de tout TEBST résiduel.
Préparer la phase dispersée dans un tube de centrifugeuse frais de 15 millilitres, à l’aide d’un mélange maître PCR, des amorces appropriées et d’une sonde d’hydrolyse de la fluorescéine, comme décrit dans le manuscrit du texte. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes sous une agitation douce, à l’aide d’un rotateur tubulaire. Centrifuger la phase dispersée à 6000 x g pendant une minute et retirer le surnageant.
Ajouter un microlitre d’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae à la pastille et bien mélanger par pipetage ou tapotement vigoureux. Ajouter 200 microlitres de fluorosurfactant à 2% dans l’huile HFE au tube, pour l’émulsification. Délogez la pastille en pipetant ou en tapotant le tube, puis vortexez à 3000 tr / min pendant 30 secondes.
Laissez les émulsions se déposer pendant une minute, puis retirez 100 microlitres de la phase huileuse inférieure et remplacez ce volume par du fluorosurfactant frais à 2% dans de l’huile HFE. Inverser doucement le tube plusieurs fois pour mélanger. Répétez cette opération trois fois ou plus, jusqu’à ce que les petites gouttelettes satellites soient enlevées.
Après deux à cinq minutes de décantation, retirez la phase d’huile inférieure. Remplacez ce volume par un fluorosurfactant à 5% dans l’huile de fluorocarbone. Pipette 100 microlitres d’échantillon dans des tubes PCR de 200 microlitres et placez les tubes PCR dans un thermocycleur.
Pipettez l’échantillon sur une lame de comptage pour l’imagerie fluorescente et imagez l’échantillon. L’émulsification à gabarit de particules offre une superbe monodispersité. Au fur et à mesure que l’excès de surnageant est éliminé, un tensioactif stabilisateur est ajouté et l’échantillon est vortexé pour générer l’émulsion.
Les gouttelettes résultantes sont constituées d’un noyau de particules et d’un échantillon aqueux contenant des réactifs et des molécules ou cellules d’échantillon nécessaires à la réaction. Les gouttelettes polydispersées avec des particules de modélisation indiquent un vortex insuffisant. Un autre problème est la génération de satellites excessifs, qui réduisent l’efficacité de l’encapsulation.
Les satellites ne doivent pas représenter plus de 10 % du volume total de l’échantillon encapsulé. Ils peuvent être éliminés de l’émulsion en les lavant avec de l’huile fraîche. L’utilité de la PTE peut être démontrée dans la PCR numérique lorsque des gouttelettes contenant des cibles amplifiées deviennent fluorescentes, ce qui permet une quantification directe des cibles.
Les gouttelettes fluorescentes donnent peu de points positifs lorsque la cible est rare, et beaucoup lorsqu’elle est abondante. Ces résultats sont reproductibles en utilisant des particules de polyacrylamide disponibles dans le commerce, permettant d’obtenir des mesures précises sur la même plage. L’élimination du surnageant de la phase de dispersion est importante pour l’encapsulation de l’échantillon.
Connaître le volume de la pastille et du surnageant peut aider à identifier l’interface entre les deux. En cas de doute, errez du côté de l’élimination du surnageant.
