Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la réparation et de la régénération des tissus au sujet des associations entre les voies cytoprotectrices, le stress oxydatif et la réponse à la cicatrisation des plaies. Le principal avantage de cette technique puissante est que vous pouvez mesurer les espèces réactives d’oxygène dans une plaie, en temps réel, pour déterminer leur impact sur la régénération des tissus. Jennifer Kwong, assistante de recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec moi.
Utilisez un glucomètre pour mesurer la glycémie de chaque souris diabétique anesthésiée de huit à 12 semaines. Et utilisez un coupe-cheveux et une crème depilatory pour enlever les cheveux dorsales du premier animal. Utilisez des lingettes d’alcool deux fois pour nettoyer la peau exposée et draper l’animal de sorte que seule la zone chirurgicale est exposée.
Lorsque l’alcool a séché, utilisez des poinçons stériles de biopsie de 10 millimètres pour créer deux plaies de 10 millimètres d’épaisseur qui s’étendent à travers le carnosus panniculus selon une technique excisionnelle bien établie de cicatrisation des plaies. Utilisez une feuille de silicone de 0,5 millimètre d’épaisseur avec des découpes circulaires de 10 millimètres pour attiser les plaies ouvertes et fixer les relais avec des sutures de soie interrompues 4/0. Placez ensuite les souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la récupération complète, avant de retourner à sa cage individuelle, en fournissant des serviettes en papier comme matériau de nidification supplémentaire pendant deux semaines.
Le lendemain, appliquez soit un petit gel d’ARN interférant de contrôle, soit un petit gel keap1 expérimental interférant sur le dessus de la plaie de chaque animal et enveloppez chaque torse d’un pansement transparent pour maintenir le gel en place tout en laissant les membres libres. Au troisième jour de l’expérience, chargez une seringue d’un millimètre munie d’une aiguille de calibre 27 avec une solution L-012 fraîchement préparée et enveloppez la seringue pour protéger la solution de la lumière. Pour filmer les plaies, retirez doucement le pansement transparent de chacune des souris sans déranger les plaies et placez les souris dans la chambre d’imagerie d’un système d’imagerie par bioluminescence.
Réglez l’afflux du système d’imagerie et les niveaux d’oxygène de la chambre d’induction à un litre par minute et imagez les souris par bioluminescence et champ lumineux à la ligne de base. Ensuite, essuyez les abdomens avec des lingettes d’alcool, puis injectez cinq milligrammes de solution L-012 par poids corporel de 200 grammes, IP, dans chaque souris une fois que l’alcool a séché. L’injection de la solution L-012 sans déranger les plaies sur la peau dorsale est essentielle, car toute distorsion affectera la trajectoire de cicatrisation des plaies et l’interprétation des données.
Assurez-vous que l’animal est solidement en récumbence dorsale avant l’injection. Immédiatement après l’injection, remettre les souris dans leurs emplacements respectifs dans la chambre d’imagerie et l’image des animaux pendant une minute toutes les quatre minutes sur une période d’imagerie de 60 minutes, définissant la plaie de 10 millimètres comme la région d’intérêt pour déterminer le niveau d’espèces réactives d’oxygène. Placez ensuite les souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’elles se rétablissaient complètement avant de retourner les animaux dans leurs cages individuelles.
Trois jours après avoir créé des blessures bilatérales selon le modèle excisional établi de blessure, aucune bioluminescence n’est observée avant l’injection de L-012. Après l’injection intraperintoneal de solution L-012, la bioluminescence est observée dans les secteurs de la blessure où des espèces réactives d’oxygène sont détectées. L’enregistrement de la bioluminescence pendant une minute toutes les quatre à cinq minutes sur une période de 60 minutes démontre la saturation bioluminescente de la région d’intérêt au fil du temps, avec le temps d’imagerie optimal pour atteindre la saturation complète de L-012 observée à environ 50 minutes.
La bioluminescence dans chaque région d’intérêt de blessure avant et après injection de L-012 dans le petit ARN interférant non-sens traité ou keap1 petites souris traitées par ARN interférant peut alors être calculée en divisant les comptes totaux de l’intensité lumineuse par la région. L’analyse des sections de tissu de blessure de jour 10 pour confirmer l’exactitude de la mesure réactive de niveau d’espèce d’oxygène par la coloration de H&E indique une infiltration cellulaire réduite dans de petites blessures traitées par Keap1 interférant par rapport aux petits tissus traités non-sens interférants, indiquant une morphologie inflammatoire réduite chez les animaux gel-traités expérimentaux. L’analyse de l’immunoréactivité de F4/80, un marqueur macrophage de protéine sur des sections de tissu de blessure, indique un nombre réduit de macrophages dans de petites blessures traitées par Keap1 interférant par rapport aux petites blessures non-traitées interférantes, soulignant davantage la validité de cette méthode.
Lorsque vous essayez cette procédure, assurez-vous de confirmer que le L-012 n’est pas expiré et de remuer la solution dans un endroit protégé de la lumière. À la suite de cette procédure, des sondes ciblées et des méthodes basées sur l’immuno-analyse peuvent être utilisées pour étudier la localisation subcellulaire des espèces réactives d’oxygène et leurs corrélats, permettant une évaluation rapide des interventions et des mécanismes qui affectent les statistiques redux des plaies.
