Ce protocole permet la quantification cellulo de l’ADN et la résection suite à des dommages à l’ADN. Le principal avantage de cette technique est le marquage du cycle cellulaire qui limite les cellules à la phase S et G2, garantissant que le signal de bromodéoxyuridine résulte de l’ADN et de la résection. Jean-Yves Masson, chercheur principal, et Sofiane Y.Mersaoui, chercheur postdoctoral, feront la démonstration de la procédure.
En travaillant sous une hotte stérile, placez un seul couvercle dans chaque puits d’une plaque de six puits pour autant de conditions que nécessaire. Plaquez environ 150 000 cellules HeLa pour la transfection ou le traitement médicamenteux. Le troisième jour, après l’incubation de nuit avec BrdU à une concentration finale de 10 micromolaires, irradier les plaques avec une dose totale de cinq gris d’irradiation aux rayons X.
Après l’irradiation, retourner les plaques pour l’incubation à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% d’oxyde de carbone pendant trois heures. Pour la pré-extraction, aspirer le milieu et laver soigneusement les cellules deux fois avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez deux millilitres de tampon de pré-extraction A et incubez les cellules à quatre degrés Celsius sur de la glace pendant 10 minutes.
Après 10 minutes, aspirez le tampon A, ajoutez deux millilitres de tampon de décapage du cytosquelette B et répétez l’incubation. Ensuite, aspirez soigneusement le tampon B et lavez les cellules avec du PBS. Après avoir aspiré le PBS, fixez les cellules en ajoutant deux millilitres de 4% de paraformaldéhyde sous le capot chimique.
Après avoir retiré le paraformaldéhyde et les lavages avec du PBS, couvrir les couvercles avec du méthanol 100% froid pour une incubation à moins 20 degrés Celsius pendant cinq minutes et laver les couvercles deux fois avec du PBS. Pour la perméabilisation, incuber les cellules avec deux millilitres de PBS contenant 0,5% de Tritan X-100 à température ambiante. Après 15 minutes, laver les couvercles trois fois avec deux millilitres de PBS.
Pour l’immunocoloration, ajoutez deux millilitres de tampon bloquant à chaque puits. Après une heure d’incubation, ajouter 100 microlitres de solution d’anticorps primaires à chaque couvercle. Utilisez une pince à épiler pour recouvrir les couvercles de parafilm carré et positionnez soigneusement le parafilm pour ne pas créer de bulles.
Ensuite, recouvrez la plaque de papier d’aluminium et incubez l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Le lendemain, retirez les carrés de parafilm et lavez les couvercles trois fois avec deux millilitres de PBS. Après le lavage, ajouter 100 microlitres de solution d’anticorps secondaires sur chaque couvercle et recouvrir les couvercles d’un carré de parafilm comme démontré.
Incuber l’anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure et protéger la plaque de la lumière à l’aide d’une feuille. Ensuite, lavez les couvercles trois fois avec deux millilitres de PBS 1X. Pour la coloration nucléaire, ajoutez deux millilitres de solution de DAPI à chaque couvercle et lavez les couvercles avec du PBS.
Ajoutez 10 à 20 microlitres de support de montage spécifique à la FI sur les lames de microscope. Utilisez l’aiguille ou une pince à épiler fine pour soulever le couvercle du fond du puits. Épongez soigneusement l’excès de liquide en tapotant doucement un bord sur une serviette en papier et montez les couvercles sur des lames de microscope.
Pour l’acquisition et l’analyse d’images, importez ces fichiers dans CellProfiler et analysez-les à l’aide du pipeline de comptage de mouchetures. Identifiez l’objet principal pour identifier les foyers à l’aide des paramètres décrits dans le manuscrit textuel et mesurez l’intensité. Des images représentatives de la formation de foyers de 5-bromo-2-prime-désoxyuridine et de la coloration proliférante de l’antigène nucléaire cellulaire après irradiation sont présentées ici.
Les pistes d’ADN monocaténaire générées ont été visualisées comme des foyers distincts. Les foyers identifiés ont ensuite été quantifiés et exprimés comme l’intensité totale intégrée de la coloration à la bromodésoxyuridine dans les noyaux. La cocoloration a montré une différenciation entre la résection à courte portée due à la jonction d’extrémité non homologue et la résection à longue distance de la recombinaison homologue à l’aide d’un anticorps anti-PCNA pour identifier les cellules passant par la phase S.
Le PCNA est proéminent dans le noyau et atteint une expression maximale pendant la phase S du cycle cellulaire avec une coloration assez intense. Les valeurs du résultat sont ensuite tracées sous forme de nuage de points pour faire la distinction entre les noyaux PCNA positif et PCNA négatif. Les résultats négatifs du PCNA sont retirés de l’ensemble de données pour permettre une analyse basée sur l’intensité BrdU en raison du faible signal BrdU quelle que soit la condition.
Les noyaux négatifs PCNA abritent une intensité basale intégrée de foyers BrdU de 900 unités arbitraires et cette valeur atteint 1 800 UA dans les noyaux positifs PCNA. Dans la condition de contrôle du siRNA, l’intensité intégrée des foyers BrdU par noyau est d’environ 1 500 UA dans les noyaux positifs pcNA. Après une élimination efficace de PARP-1 à l’aide d’un siRNA, une augmentation significative de l’intensité des foyers BrdU à environ 1 900 UA a été observée.
Cette technique peut fournir des informations clés sur la première étape de la recombinaison homologue, aidant ainsi à identifier si une protéine est impliquée dans la première étape de la voie de réparation. Le temps d’incubation des tampons de pré-extraction doit être strictement respecté. La surexposition à ces tampons entraînera un détachement excessif des cellules et une augmentation du signal de fond.
