Il s’agit d’une méthode simple et efficace pour isoler et cultiver les péricytes primaires du cerveau pour l’étude de la signalisation intercellulaire du calcium. La culture cellulaire obtenue est une population presque homogène de péricytes, et il est facile de charger les péricytes pour l’imagerie calcique. Les méthodes décrites ici devraient fournir à d’autres chercheurs sur le terrain des outils solides pour étudier la biologie péricyte, et la signalisation intracellulaire chez les péricytes in vitro.
Commencez par décongeler une fiole de capillaires dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Une fois que les capillaires ont décongelé, transférez-les dans un tube de centrifugeuse avec 30 millilitres de maquette DMEM, et centrifugez-les pendant cinq minutes à 500 fois G.Then, retirez le milieu du tube et suspendez la palette en 10 millilitres de maquette DMEM fraîche. Transférer la suspension dans un flacon T-75 enduit et permettre aux capillaires d’adhérer au fond pendant quatre à six heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius alimenté à 10 % de dioxyde de carbone.
Après l’incubation, inspecter le flacon au microscope léger. Des fractions de capillaires doivent maintenant être fixées au fond du flacon. Le quatrième jour après l’ensemencement des capillaires, inspectez-les au microscope pour vous assurer qu’ils sont environ 60 à 70 % confluents.
Aspirez le milieu et lavez doucement les cellules avec du PBS. Ajouter deux millilitres de trypsine-EDTA décongelée, et laisser le flacon dans l’incubateur pendant une à trois minutes, en prenant le flacon fréquemment, et en observant le détachement cellulaire avec le microscope. Lorsque les cellules endothéliales commencent à arrondir, appuyez doucement sur le flacon pour les détacher.
Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la trypsinisation en ajoutant 10 millilitres de maquette DMEM au flacon. Rincer le flacon à quelques reprises avec le milieu, et aspirer la suspension cellulaire endothéliale, qui peut maintenant être utilisé à d’autres fins. Ajouter 10 millilitres de maquette DMEM au flacon, et le vérifier au microscope léger pour s’assurer que les péricytes sont toujours présents et fixés au fond.
Ensuite, remettre le flacon dans l’incubateur pour permettre à la culture enrichie de péricyte de croître. Pour ensemencer les péricytes dans des plaques enduites de 96 puits, détachez-les comme décrit dans le manuscrit du texte. Aspirez le milieu, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire, et re-suspendre la pastille dans un millilitre de maquette DMEM frais.
Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage, puis calculez le volume de suspension qui doit être ajouté à chaque puits pour ensemencer 10 000 cellules par puits. Ajouter la suspension cellulaire, puis ajouter suffisamment de maquette DMEM aux cellules pour atteindre un volume total de 200 microlitres par puits. Lorsque vous êtes prêt à charger les péricytes avec du colorant indicateur de calcium Fura-2 AM, prenez la plaque de 96 puits avec les cellules hors de l’incubateur, et aspirez le milieu des puits.
Lavez les cellules deux fois avec un tampon d’essai, et ajoutez 100 microlitres de solution de chargement à chaque puits. Enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment photo, et incubez-la pendant 45 minutes avec 30 RPM secouant à température ambiante. Après l’incubation, aspirer le tampon de chargement, et laver les cellules avec le tampon d’essai deux fois.
Ajouter 100 microlitres de frais au tampon d’essai, et laisser les cellules à incuber pendant 30 minutes. Après l’incubation, réglez la température du lecteur de plaque à 37 degrés Celsius, et transférez la plaque de 96 puits avec des cellules à la position de la plaque de l’échantillon, puis placez la plaque du reagent avec un agoniste à la position de la plaque de réaccente. Commencez par mesurer la charge des cellules pour assurer une charge égale de Fura-2 AM dans tous les puits, puis effectuez les mesures avec la longueur d’onde de fluorescence d’excitation à 340 à 380 nanomètres, et la longueur d’onde d’émission à 510 nanomètres.
Ajouter 50 microlitres d’agoniste, à une vitesse de 150 microlitres par seconde, de la plaque de réaccente à chaque puits avec des cellules. Montez un couvercle glisser dans la chambre cellulaire, et le serrer pour éviter les fuites. Ajoutez la maquette DMEM et le volume calculé de suspension cellulaire dans chaque chambre, pour un volume final de 500 microlitres.
Incuber les chambres cellulaires à 37 degrés Celsius et 10 % de dioxyde de carbone pendant six jours, ou jusqu’à ce qu’elles soient confluentes. Une fois que les cellules sont confluentes, sortez les chambres cellulaires de l’incubateur et aspirez le milieu. Lavez les cellules deux fois avec un tampon d’essai, et ajoutez 500 microlitres de tampon de chargement à chaque chambre, puis incubez-les à température ambiante pendant 45 minutes.
Après l’incubation, aspirer le tampon de chargement, et laver les cellules deux fois avec tampon d’essai, puis ajouter 500 microlitres de tampon d’essai frais à chaque chambre et les incuber pendant encore 30 minutes à température ambiante, pour permettre le clivage de l’ester AM. Remplacez le tampon par 500 microlitres de tampon d’essai frais et procédez à l’imagerie en direct au microscope confocal. Montez la chambre cellulaire sur la scène du microscope aussi doucement que possible pour éviter la perturbation des cellules.
Réglez la longueur d’onde excitation à 488 nanomètres, émission à 515 nanomètres, acquisition d’image séquentielle de deux minutes avec cinq intervalles de seconde, et une taille d’image x, y de 512 par 512 pixels. Ajouter 300 microlitres de 100 milli molaires ATP à la chambre cellulaire, et initier l’acquisition d’images. Ce protocole a été utilisé pour purifier les péricytes des capillaires cérébraux bovins.
L’excroissance cellulaire des capillaires ensemencés a été photographiée au cours de neuf jours. Les capillaires étaient entièrement attachés au flacon au premier jour, et au deuxième jour, la germination endothéliale était visible. Après quatre jours, l’excroissance cellulaire était distinctive, et les cellules endothéliales ont été enlevées par trypsinization.
Des restes des capillaires étaient présents après la trypsinisation, mais ont disparu du flacon dans les jours suivants. Après l’enlèvement de la couche endothéliale, les péricytes ont été autorisés à croître jusqu’à la confluence. Le neuvième jour, les péricytes atteignaient environ 80 % de confluent et formaient des îles.
L’ajout de l’ATP aux péricytes chargés Fura-2 a entraîné une augmentation des niveaux cytosoliques de calcium. La réponse s’est produite immédiatement après l’ajout de l’ATP aux péricytes, et a diminué lentement au cours de la période mesurée. La réponse de calcium a également été mesurée avec la formation image confocale en temps réel.
La fluorescence de ligne de base a été mesurée, puis l’ATP a été ajouté à 64 secondes, et une réponse intracellulaire forte de calcium était évidente. Peu de temps après, le calcium cytosolique compartimenté dans les cellules, et une réduction de la zone cellulaire était visible. Par 300 secondes, la zone cellulaire fortement réduite, et la fluorescence a diminué presque aux niveaux de ligne de base.
Cette méthode a été utilisée pour obtenir les premières mesures intracellulaires du calcium à partir de péricytes capillaires cérébraux primaires, démontrant que les péricytes sont stimulés par l’ATP, et sont capables de se contracter in vitro.
