Cette méthode a été conçue pour quantifier la concurrence dépendante du contact via le système de sécrétion de type VI entre les souches bactériennes au niveau de la cellule unique. Cette technique utilise la surface cellulaire totale plutôt que le nombre de cellules pour quantifier les compétitions bactériennes, ce qui facilite la tâche des chercheurs sans accès à un logiciel d’analyse d’images propriétaire. Cette méthode peut être facilement modifiée pour quantifier la concurrence entre divers microbes cultivables.
De plus, la configuration expérimentale peut être optimisée pour une utilisation sur des microscopes verticaux ou inversés. Pour commencer, préparez la solution de tampon d’agarose en dissolvant 2% d’agarose à faible teneur en matière fondue dans le PBS marin. Chauffer brièvement la solution pendant environ 30 secondes au micro-ondes et dans le vortex jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
Conservez cette solution dans un bain-marie à 55 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Ensuite, enroulez un morceau de ruban adhésif de laboratoire autour d’une lame de verre cinq fois. Répétez l’emballage du ruban adhésif sur la même diapositive, de sorte que la distance entre les deux morceaux de ruban soit légèrement inférieure à la largeur du couvercle.
Pour assurer une surface plate de tampon d’agarose, pipettez la solution d’agarose chaude entre les deux morceaux de ruban adhésif et placez immédiatement un couvercle sur le dessus de sorte que le couvercle entre en contact avec le liquide et pousse les bulles dans la solution d’agarose. Laissez le tampon d’agarose se solidifier à température ambiante pendant au moins une heure. Ensuite, coupez ce tampon d’agarose avec une lame de rasoir en quatre coussinets de 5 millimètres carrés à utiliser pour l’imagerie.
Pour préparer les souches à la co-incubation, coupez chaque souche des stocks congelés sur les plaques de gélose LBS complétées par les antibiotiques appropriés et incubez pendant la nuit à 24 degrés Celsius. Le lendemain, choisissez deux colonies de chaque souche et ressuspendez les colonies dans un milieu LBS supplémenté aux antibiotiques. Incuber les colonies ressuspenées pendant la nuit à 24 degrés Celsius avec des secousses à 200 rotations par minute.
Le lendemain matin, chaque sous-culture biologique en réplique une dans un milieu LBS 1 000 fois frais sans antibiotiques et incube jusqu’à ce que les cellules atteignent une densité optique d’environ 1,5 à 600 nanomètres. Mesurez et enregistrez la densité optique à 600 nanomètres pour tous les échantillons. Normaliser chaque échantillon à une densité optique de un en diluant la culture avec un milieu LBS.
Mélangez les deux souches concurrentes à un rapport égal en ajoutant 30 microlitres de chaque souche normalisée à un tube étiqueté de 1,5 millilitre. Vortex la culture de souche mixte pendant une à deux secondes. Mélanger les souches concurrentes pour chaque réplique biologique et traitement pour générer un total de quatre tubes de souches mixtes.
Concentrez chaque culture mixte trois fois par centrifugation pour assurer des cellules concurrentes suffisamment denses pour la destruction dépendante du contact pendant la co-incubation. Jetez le surnageant, ressuspendez chaque pastille dans 20 microlitres de milieu LBS et effectuez des procédures de concentration pour chaque échantillon. Si vous imaginez sur un microscope inversé, commencez par repérer deux microlitres d’une culture mixte sur le fond de couverture numéro 1,5 d’une boîte de Petri de 35 millimètres et placez le tampon d’agarose sur le point de co-incubation.
Placez un couvercle en verre circulaire de 12 millimètres sur le tampon d’agarose. Répétez le repérage et le placement de la lèvre de couverture pour les trois cultures mixtes restantes, ce qui entraînera l’imagerie de quatre plats. Avant d’aller de l’avant, laissez les glissières reposer sur la paillasse pendant environ cinq minutes pour permettre aux cellules de se déposer sur le coussinet d’agar afin d’éviter tout mouvement pendant le processus d’imagerie.
Commencez par vous concentrer sur les cellules à l’aide de DIC pour minimiser les effets de photobleaching. Sur la base de la taille moyenne d’une seule cellule bactérienne, utilisez un objectif d’huile 100X. Ajustez le temps d’exposition et les paramètres d’acquisition pour chaque canal avec une détection d’arrière-plan minimale.
Sélectionnez au moins cinq champs de vision et acquérez des images dans chaque canal approprié. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images et importez les fichiers image à analyser. Convertissez l’image en niveaux de gris, séparez les couches et commencez par le seuillage et la création d’un masque binaire de l’image prétraitée.
Sélectionnez Analyser, puis dans le menu déroulant, sélectionnez Définir l’échelle et entrez les valeurs appropriées pour la configuration de la microscopie. Ensuite, allez à définir les mesures et sélectionnez Zone. Sous l’onglet Analyser, sélectionnez Analyser les particules à l’aide des paramètres par défaut.
Si des débris sont présents dans l’échantillon, la taille ou la circularité peut être ajustée pour filtrer les particules non cellulaires. Sélectionnez Afficher, puis Contours afin que la sortie de l’analyse de filtrage inclue un contour numéroté de toutes les particules analysées. Exportez les mesures dans un tableur pour une analyse et une représentation graphique plus approfondies.
Les images de fluorescence représentatives de chaque traitement expérimental sont montrées. La concentration de la culture mixte avant la mise au point a entraîné l’arrondi ou la disparition des cellules cibles pendant deux heures, ce qui indique une inhibition réussie. Lorsque la culture mixte n’est pas concentrée, les cellules restent dispersées sur la lame.
Sans un contact suffisant de cellule à cellule, la souche cible n’est pas inhibée par la souche létale. Les cellules cibles n’ont ni disparu ni ne se sont arrondies lorsqu’elles ont été co-incubées avec un mutant T6SS dans des conditions surpeuplées ou dispersées. Ainsi, la cible était décomplexée dans l’un ou l’autre traitement.
Les résultats de l’analyse des particules ont été représentés graphiquement et analysés pour la souche cible et la souche inhibitrice. Plus de 100 % de la zone cible initiale au point temporel final représente une augmentation nette de la cible et moins de 100 % de la zone cible initiale indique une diminution nette de la cible. La croissance nette de la souche inhibitrice a été observée dans tous les traitements.
Cependant, le pourcentage de la surface initiale de la souche inhibitrice était significativement plus élevé lorsqu’un inhibiteur de type sauvage était co-incubé avec la cible dans des conditions de surpeuplé par rapport à tous les autres traitements. Pour obtenir des images claires, le tampon agarose doit être aussi plat que possible. Coupez des morceaux de ruban adhésif avant de les enrouler autour de la glissière pour vous assurer qu’ils ont la même longueur.
