Méthodes de culture directe et indirecte pour l’étude in vitro de matériaux implantaires biodégradables. Au cours des dernières décennies, les matériaux biodégradables ont été largement explorés pour des applications biomédicales, telles que les implants orthopédiques, dentaires et maxillo-faciaux crâniens. pour dépister les matériaux biodégradables pour des applications biomédicales, il est nécessaire d’évaluer ces matériaux en termes de réponses cellulaires in vitro, de cytocompatibilité et de cytotoxicité.
Les normes de l’Organisation internationale de normalisation ont été largement utilisées dans l’évaluation des biomatériaux. Cependant, la plupart des normes ISO ont été établies à l’origine pour évaluer la toxicité de style des matériaux non dégradables, offrant ainsi une valeur limitée pour le criblage des matériaux biodégradables. Dans cette vidéo, nous présenterons et discuterons de trois méthodes de culture différentes, à savoir la méthode de culture directe, la méthode de culture d’exposition directe et la méthode de culture d’exposition pour évaluer la cytocompatibilité in vitro de matériaux implantaires biodégradables.
Plus précisément, la méthode de culture directe évalue les interactions entre les cellules nouvellement ensemencées et les implants. La culture d’exposition directe imite les interactions entre les cellules établies dans le corps et les implants. La culture d’exposition caractérise les interactions entre les cellules établies et les implants lorsqu’elles ne sont pas en contact direct les unes avec les autres mais dans le même environnement où les matériaux se dégradent.
Cette vidéo fournit des exemples d’utilisation de ces trois méthodes de culture pour étudier la cytocompatibilité in vitro des matériaux implantaires biodégradables et leurs interactions avec les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse. Les méthodes in vitro décrites dans cette vidéo imitent différents scénarios de l’environnement in vivo, élargissant l’applicabilité et la pertinence des tests de cytocompatibilité in vitro de différents matériaux pour diverses applications biomédicales. Nous suivons un protocole approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Community de l’Université de Californie à Riverside pour le prélèvement de cellules et de tissus.
Préparation de la culture cellulaire. Les trois méthodes de culture décrites dans cette vidéo sont généralement applicables à différents types de cellules adhérentes. Ici, les BMSC récoltés sur des sevrés de rats seront introduits comme exemple de préparation de culture cellulaire Récolte de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse à partir de sevrages de rats.
Le diagramme schématique de cette figure montre les étapes à suivre pour récolter les BMSC des sevrés de rats. Retirez la peau, les muscles et les tissus conjonctifs pour disséquer le fémur du rat euthanasié. Placer les os fémoraux dans un tube conique de 15 mL contenant des milieux de culture cellulaire.
Placez les tubes coniques sur de la glace jusqu’au moment de l’extraction cellulaire. Transférer les os dans une boîte de Petri dans l’armoire de sécurité biologique. Coupez les extrémités de l’os à l’aide d’une lame chirurgicale et rincez la moelle osseuse dans un tube conique de 50 mL en lavant la cavité de la moelle osseuse avec un milieu de culture cellulaire à l’aide d’une seringue avec l’aiguille de calibre 25 1/2.
Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre de 70 micromètres suivi d’une centrifugation à 126 fois la gravité pendant cinq minutes pour obtenir les pastilles cellulaires Aspirer les milieux surnageants et les reconstituer avec 10 mL de milieux frais. Pipettez doucement de haut en bas pour remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Pipettez la suspension directement sur le fond intérieur d’une fiole T-75 et ajoutez du support pour porter le volume à 25 millilitres.
Cultivez les cellules dans un incubateur dans un environnement de culture cellulaire stérile standard de 37 degrés Celsius, une atmosphère humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’air. Après trois à sept jours, rincez les cellules non adhérentes en aspirant les anciens milieux et en les reconstituant avec des milieux frais. Continuez à cultiver et à nourrir les cellules avec des milieux frais jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le passage cellulaire, la congélation ou l’utilisation dans une expérience.
Préparation et stérilisation des échantillons. Stériliser ou désinfecter tous les échantillons avant la culture cellulaire. Les méthodes de stérilisation ou de désinfection pour différents types d’échantillons varient en fonction des différentes propriétés des matériaux.
En général, utilisez le rayonnement ultraviolet pour désinfecter les métaux biodégradables pour les études in vitro. Méthodes de culture cellulaire. Le diagramme schématique de cette figure montre les étapes de la méthode de culture directe.
Dans cette vidéo, les BMSC ont été cultivés sur une plaque dérivée du magnésium placée à l’intérieur des puits d’une plaque traitée par culture tissulaire de 12 puits à titre d’exemple pour illustrer la méthode de culture. Utilisez une fiole confluente à 90 % pour déterminer la concentration cellulaire dans la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension cellulaire à l’aide de milieux frais à une concentration cellulaire prescrite nécessaire à l’étude cellulaire in vitro.
Placez les échantillons au centre des plaques de culture tissulaire à 12 puits. Rincer les plaques de culture avec 2 mL de PBS et 2 mL de DMEM séquentiellement pour calibrer la pression osmotique dans des conditions stériles. Ajouter 3 mL de suspension cellulaire diluée dans chaque puits sur les échantillons d’intérêt.
Cultivez les cellules dans un incubateur dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 heures. Le diagramme schématique en défiguration montre les étapes de la culture d’exposition directe. Préparer la suspension cellulaire avec les concentrations requises de cellules en fonction de la conception expérimentale pour différents types de cellules et applications prévues.
Rincer les plaques de culture avec 2 mL de PBS et 2 mL de DMEM séquentiellement pour calibrer la pression osmotique dans des conditions stériles. Ajouter 3 mL de la suspension cellulaire diluée dans chaque puits. Cultivez les cellules dans l’incubateur humidifié dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 heures ou jusqu’à ce que les cellules atteignent 50% à 80% de confluence.
Après 24 heures de rinçage, les cellules de la plaque de puits avec PBS à l’aide d’une pipette pour éliminer les cellules mortes flottantes. Placez les échantillons désinfectés ou stérilisés directement sur les cellules adhérentes. Ajouter 3 mL de média frais dans chaque puits.
Cultivez les cellules dans des conditions de culture cellulaire standard pendant encore 24 heures. Le diagramme schématique de cette figure montre les étapes de la méthode de culture d’exposition. Les premières étapes de la préparation cellulaire sont les mêmes que la culture d’exposition directe.
Ensuite, placez les échantillons dans les inserts de puits avec une taille de pore membranaire de 0,4 micromètre et placez les inserts de puits avec les échantillons dans chaque puits avec les cellules. Cultivez les cellules dans des conditions de culture cellulaire standard pendant encore 24 heures. Caractérisation post-culture des cellules.
Pour la culture directe et la culture d’exposition directe, fixez, coloriez, imagez et analysez les cellules adhérentes sur les plaques de puits et les échantillons. Pour la culture d’exposition, analysez les cellules collées aux plaques de puits. Recueillir les milieux post-culture de chaque puits dans un tube conique correspondant de 15 mL pour une analyse plus approfondie.
Prélever tous les échantillons après la culture pour une analyse plus approfondie. Rincez les cellules adhérentes sur les échantillons et les plaques de puits trois fois à l’aide de PBS. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque plaque de puits.
Remettez le couvercle sur la plaque du puits et laissez le PFA réagir pendant 20 minutes. Après 20 minutes, aspirez le PFA et distribuez-le dans un flacon poubelle. Rincez la plaque du puits trois fois à l’aide de PBS pour éliminer le PFA et transférer les déchets dans le flacon de déchets.
Préparez les stocks de travail des agents de coloration en suivant les instructions du fabricant. Ajouter 200 à 400 microlitres d’agent colorant alexa Fluor 488 Phalloidin dilué à chaque puits pour couvrir les cellules de la plaque du puits et l’échantillon. Enveloppez la plaque du puits dans du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière et permettre à l’Alexa Fluor 488 Phalloidin de réagir pendant 20 minutes à température ambiante.
Collectez l’agent colorant Alexa Fluor 488 Phalloidin et distribuez-le dans le flacon de déchets correspondant. Rincez les plaques murales trois fois à l’aide de PBS pour éliminer l’excès de phalloïdine Alexa Fluor 488 et distribuer le PBS usagé dans le flacon de déchets correspondant. Ajouter 200 à 400 microlitres de DAPI dilué à chaque puits pour couvrir les cellules du puits et de l’échantillon.
Enveloppez la plaque du puits dans du papier d’aluminium et laissez le DAPI réagir pendant cinq minutes à température ambiante. Rincez la plaque du puits trois fois à l’aide de PBS et distribuez le PBS usagé dans le flacon de déchets correspondant. Après la coloration, imagez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Dans la mesure du possible, prenez des images de cellules à contraste de phase en plus des images de fluorescence. Imagez les cellules sur les échantillons biodégradables dès que possible ou immédiatement après la coloration pour éviter ou réduire les changements possibles causés par la dégradation continue des échantillons. Pour la culture directe et la culture d’exposition directe, imagez et évaluez deux types de cellules.
Premièrement, les cellules des échantillons en contact direct avec les échantillons, et deuxièmement, les cellules ont adhéré sur la plaque du puits entourant les échantillons en contact direct avec les échantillons, comme le montre la figure. Pour la culture d’exposition, comme indiqué ici, utilisez le guide d’image lorsque vous prenez les images de fluorescence des cellules pour déterminer si la réponse de la cellule serait différente en réponse au gradient de dégradation dynamique des échantillons. Imagez et analysez les cellules situées dans la zone située à l’intérieur de l’anneau intérieur, à 3,5 mm du centre, et de l’anneau extérieur, qui est à 7 mm du centre séparément.
Pour chaque échantillon, et dans les plaques de culture, prenez au hasard au moins cinq images de chaque zone d’intérêt où les cellules sont soit en contact indirect, soit en contact indirect avec les échantillons à une distance prédéfinie. À partir de toutes les images cellulaires obtenues à partir de l’étape 4.3, quantifiez la morphologie cellulaire en mesurant la zone d’étalement cellulaire et le rapport d’aspect pour l’analyse d’image. Comptez le nombre de cellules dans chaque zone de l’image.
Calculez la densité d’adhérence des cellules dans des conditions de contact direct et indirect comme le nombre de cellules par unité de surface. Analyses postculturelles de médias et d’échantillons. Avant l’auto-fixation, collectez les supports de postculture.
Mesurez les valeurs de pH des milieux de postculture dans chaque puits immédiatement après la collecte à l’aide d’un pH-mètre précalibré. Après l’étape précédente de la mesure du pH, collectez et diluez le milieu à l’aide d’un facteur de dilution souhaitable pour des mesures optimales des concentrations d’ions. Mesurer les concentrations des ions d’intérêt dans le milieu de post-culture à l’aide d’un spectromètre d’émission plasma-optique à couplage inductif abrégé en ICP-OES.
Après l’étude cellulaire in vitro, les échantillons biodégradables peuvent changer de dimension, de masse, de morphologie de surface, de microstructure et de composition. L’analyse postculturenelle des échantillons aide à comprendre le mécanisme de dégradation des échantillons. Après la culture cellulaire, prenez les photographies des échantillons pour montrer les changements possibles dans la dimension, la couleur, la morphologie et d’autres caractéristiques visibles de l’échantillon.
Sécher ou déshydrater les échantillons de postculture et mesurer la masse, la dimension et le volume de l’échantillon pour quantifier tout changement de masse, de dimension et de volume. Utilisez un microscope électronique à balayage pour caractériser la microstructure et la morphologie des échantillons. Utilisez la spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie et la déferaction des rayons X pour caractériser la composition et la phase des produits de dégradation sur les échantillons.
Utilisez FTIR ou ATR pour détecter la liaison chimique sur les surfaces de l’échantillon. Résultats représentatifs. Ici, la figure montre les images de fluorescence représentatives de cellules souches dérivées de la moelle osseuse dans des conditions de contact direct et indirect en utilisant différentes méthodes de culture.
Cette figure montre les exemples de données pour la densité d’adhésion cellulaire quantifiée. Comme le montre la figure A, dans la culture d’exposition directe de 24 heures, les BMSC en contact direct avec le ZC21 ont une densité d’adhésion cellulaire significativement plus élevée que tout autre groupe. Comme le montre la figure B, dans la condition de contact indirect de la culture d’exposition directe, la densité d’adhérence BMSC est significativement plus élevée pour le groupe ZC21 que pour le groupe magnésium.
Cependant, il ne montre aucune différence significative par rapport aux groupes témoins T64 et cellules seulement. Ici, la figure A montre la valeur du pH des milieux de postculture après la culture d’exposition directe et la culture directe. Pour la culture d’exposition directe, les valeurs de pH des milieux varient de 8,3 à 8,4 pour tous les échantillons.
Dans la culture directe, les valeurs de pH des médias varient de 7,9 à 8 dans tous les groupes. La figure B montre la concentration d’ions magnésium dans les milieux de postculture. Dans la culture d’exposition directe et la culture directe, leurs concentrations d’ions magnésium dans les groupes ZC21 et magnésium sont significativement plus élevées que dans tout autre groupe témoin.
Cette figure montre les modèles XRD pour ZSr41 et le magnésium pur après une culture d’exposition de trois jours. Les phases cristallines de différentes compositions, telles que le magnésium, l’oxyde de zinc et l’hydroxyapatite, ont été observées. Ici, la figure A montre la superposition d’images SEM et de cartes EDX de la composition élémentaire de surface pour le magnésium recouvert d’oxyde de magnésium, et le contrôle des substrats de magnésium et du verre après 24 heures de culture directe avec des BMSC.
La figure B montre la composition élémentaire quantitative de surface des surfaces de l’échantillon, indiquant différents dépôts formés au cours de la culture cellulaire. Conclusions. Dans cette vidéo, nous avons présenté trois méthodes in vitro différentes pour évaluer la cytocompatibilité des matériaux implantaires biodégradables sur la base de différents modèles expérimentaux et applications prévues. Les interactions entre les matériaux et divers types de cellules pourraient être étudiées par la méthode de culture directe, la méthode de culture d’exposition directe et la méthode de culture d’exposition.
Cette vidéo a présenté des méthodes in vitro clés pour étudier l’effet des matériaux biodégradables ainsi que leurs produits de dégradation sur les comportements cellulaires pour une variété d’applications d’implants médicaux.
