طرق الاستزراع المباشرة وغير المباشرة لدراسة مواد الزرع القابلة للتحلل الحيوي في المختبر. على مدى العقود العديدة الماضية ، تم استكشاف المواد القابلة للتحلل الحيوي على نطاق واسع للتطبيقات الطبية الحيوية ، مثل زراعة العظام والأسنان والجمجمة والوجه والفكين. لفحص المواد القابلة للتحلل الحيوي للتطبيقات الطبية الحيوية ، من الضروري تقييم هذه المواد من حيث استجابات الخلايا في المختبر ، والتوافق الخلوي ، والسمية الخلوية.
وقد استخدمت المعايير في المنظمة الدولية للتوحيد القياسي على نطاق واسع في تقييم المواد الحيوية. ومع ذلك ، تم وضع معظم معايير ISO في الأصل لتقييم سمية نمط المواد غير القابلة للتحلل ، وبالتالي توفير قيمة محدودة لفحص المواد القابلة للتحلل البيولوجي. في هذا الفيديو ، سنقدم ونناقش ثلاث طرق مختلفة للثقافة وهي طريقة الثقافة المباشرة ، وطريقة ثقافة التعرض المباشر ، وطريقة ثقافة التعرض لتقييم التوافق الخلوي في المختبر لمواد الزرع القابلة للتحلل الحيوي.
على وجه التحديد ، تقوم طريقة الاستزراع المباشر بتقييم التفاعلات بين الخلايا المزروعة حديثا والغرسات. تحاكي ثقافة التعرض المباشر التفاعلات بين الخلايا الموجودة في الجسم والغرسات. تميز ثقافة التعرض التفاعلات بين الخلايا المنشأة والغرسات عندما لا تكون على اتصال مباشر مع بعضها البعض ولكن في نفس البيئة التي تتحلل فيها المواد.
يقدم هذا الفيديو أمثلة على استخدام طرق الاستزراع الثلاثة هذه لدراسة التوافق الخلوي في المختبر لمواد الزرع القابلة للتحلل الحيوي وتفاعلاتها مع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام. تحاكي الطرق المخبرية الموصوفة في هذا الفيديو سيناريوهات مختلفة للبيئة في الجسم الحي ، مما يوسع نطاق تطبيق وأهمية اختبار التوافق الخلوي في المختبر للمواد المختلفة لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية. نحن نتبع بروتوكولا معتمدا من قبل مجتمع رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة كاليفورنيا في ريفرسايد لحصاد الخلايا والأنسجة.
إعداد زراعة الخلايا. تنطبق طرق الاستزراع الثلاثة الموضحة في هذا الفيديو بشكل عام على أنواع الخلايا المختلفة الملتصقة. هنا ، سيتم تقديم BMSCs التي يتم حصادها من فطام الفئران كمثال لإعداد زراعة الخلايا حصاد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام من فطام الفئران.
يوضح الرسم البياني في هذا الشكل خطوات حصاد BMSCs من فطام الفئران. إزالة الجلد والعضلات والأنسجة الضامة لتشريح عظم الفخذ من الفئران القتل الرحيم. ضع عظام الفخذ في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على وسائط زراعة الخلايا.
ضع الأنابيب المخروطية على الجليد حتى وقت إجراء استخراج الخلايا. انقل العظام إلى طبق بتري في خزانة السلامة البيولوجية. قم بقطع أطراف العظم باستخدام شفرة جراحية واغسل نخاع العظم في أنبوب مخروطي سعة 50 مل عن طريق غسل تجويف نخاع العظم بوسائط زراعة الخلايا باستخدام حقنة باستخدام إبرة قياس 25 1/2.
قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مرشح 70 ميكرومتر متبوعا بالطرد المركزي عند 126 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق للحصول على كريات الخلية تستنشق الوسائط الفائقة وتجديدها ب 10 مل من الوسائط الطازجة. ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا باستخدام ماصة مصلية 10 مل. قم بتصغير التعليق مباشرة على الجزء السفلي الداخلي من قارورة T-75 وإضافة وسائط لرفع مستوى الصوت إلى 25 ملليلتر.
استزرع الخلايا في حاضنة في بيئة زراعة خلايا معقمة قياسية تبلغ 37 درجة مئوية ، وجو رطب مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الهواء. بعد ثلاثة إلى سبعة أيام ، اشطف الخلايا غير الملتصقة عن طريق تطمح الوسائط القديمة وتجديدها بوسائط جديدة. استمر في زراعة الخلايا وتغذيتها بوسائط جديدة حتى تصبح جاهزة لمرور الخلايا أو تجميدها أو استخدامها في تجربة.
إعداد العينات وتعقيمها. تعقيم أو تطهير جميع العينات قبل زراعة الخلايا. تختلف طرق التعقيم أو التطهير لأنواع العينات المختلفة اعتمادا على الخصائص المختلفة للمواد.
بشكل عام ، استخدم الأشعة فوق البنفسجية لتطهير المعادن القابلة للتحلل الحيوي للدراسات في المختبر. طرق زراعة الخلايا. يوضح الرسم البياني التخطيطي في هذا الشكل خطوات طريقة الثقافة المباشرة.
في هذا الفيديو ، تم استزراع BMSCs على صفيحة مشتقة من المغنيسيوم موضوعة داخل آبار صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة من 12 بئرا كمثال لتوضيح طريقة الاستزراع. استخدم قارورة متقاربة بنسبة 90٪ لتحديد تركيز الخلية في تعليق الخلية باستخدام مقياس الدم. قم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام وسائط جديدة إلى تركيز الخلية الموصوف اللازم لدراسة الخلية في المختبر.
ضع العينات في وسط ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا. شطف لوحات الثقافة مع 2 مل من PBS و 2 مل من DMEM بالتتابع لمعايرة الضغط الاسموزي تحت ظروف معقمة. أضف 3 مل من تعليق الخلايا المخفف في كل بئر إلى العينات ذات الاهتمام.
زرع الخلايا في حاضنة تحت ظروف زراعة الخلايا القياسية لمدة 24 ساعة. يوضح الرسم البياني التخطيطي في التشوه خطوات ثقافة التعرض المباشر. إعداد تعليق الخلية مع التركيزات المطلوبة من الخلايا على أساس التصميم التجريبي لأنواع الخلايا المختلفة والتطبيقات المقصودة.
شطف لوحات الثقافة مع 2 مل من PBS و 2 مل من DMEM بالتتابع لمعايرة الضغط الاسموزي تحت ظروف معقمة. أضف 3 مل من تعليق الخلايا المخفف في كل بئر. استزرع الخلايا في الحاضنة الرطبة تحت ظروف زراعة الخلايا القياسية لمدة 24 ساعة أو حتى تصل الخلايا إلى التقاء 50٪ إلى 80٪.
بعد 24 ساعة من الشطف ، تقوم الخلايا الموجودة في صفيحة البئر باستخدام PBS باستخدام ماصة لإزالة الخلايا الميتة العائمة. ضع العينات المطهرة أو المعقمة مباشرة على الخلايا الملتصقة. أضف 3 مل من الوسائط الطازجة إلى كل بئر.
استزرع الخلايا تحت ظروف زراعة الخلايا القياسية لمدة 24 ساعة أخرى. يوضح الرسم البياني التخطيطي في هذا الشكل خطوات طريقة ثقافة التعرض. الخطوات الأولية لإعداد الخلايا هي نفسها ثقافة التعرض المباشر.
بعد ذلك ، ضع العينات في إدراج البئر بحجم مسام غشاء يبلغ 0.4 ميكرومتر ووضع إدراج البئر مع العينات في كل بئر مع الخلايا. استزرع الخلايا تحت ظروف زراعة الخلايا القياسية لمدة 24 ساعة أخرى. توصيف ما بعد الزراعة للخلايا.
بالنسبة للثقافة المباشرة وثقافة التعرض المباشر ، قم بإصلاح الخلايا الملتصقة بلوحات الآبار والعينات ووصمها وتصويرها وتحليلها. بالنسبة لثقافة التعرض ، قم بتحليل الخلايا الملتصقة بألواح البئر. اجمع وسائط ما بعد الثقافة من كل بئر في أنبوب مخروطي 15 مل مقابل لمزيد من التحليل.
جمع جميع العينات بعد الثقافة لمزيد من التحليل. شطف الخلايا الملتصقة على كل من العينات ولوحات الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في كل طبق بئر.
ضع الغطاء مرة أخرى على صفيحة البئر واسمح ل PFA بالتفاعل لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، قم بشفط PFA وتوزيعه في زجاجة نفايات. شطف لوحة البئر ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة PFA ونقل النفايات إلى زجاجة النفايات.
قم بإعداد مخزون العمل من عوامل التلطيخ باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أضف 200 إلى 400 ميكرولتر من عامل تلطيخ Alexa Fluor 488 Phalloidin المخفف إلى كل بئر لتغطية الخلايا الموجودة على صفيحة البئر والعينة. لف صفيحة البئر بورق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء واسمح ل Alexa Fluor 488 Phalloidin بالتفاعل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
جمع اليكسا فلور 488 Phalloidin تلطيخ وكيل وتوزيعه في زجاجة النفايات المقابلة. شطف لوحات الحائط ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الزائدة Alexa Fluor 488 Phalloidin وتوزيع PBS المستخدمة في زجاجة النفايات المقابلة. أضف 200 إلى 400 ميكرولتر من DAPI المخفف إلى كل بئر لتغطية الخلايا في البئر وعلى العينة.
لف صفيحة البئر بورق الألومنيوم واسمح ل DAPI بالتفاعل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف لوحة البئر ثلاث مرات باستخدام PBS وتوزيع PBS المستخدمة في زجاجة النفايات المقابلة. بعد تلطيخ ، صور الخلايا باستخدام المجهر الفلوري.
كلما كان ذلك ممكنا ، التقط صورا لتباين الطور للخلايا بالإضافة إلى صور التألق. قم بتصوير الخلايا الموجودة على العينات القابلة للتحلل الحيوي في أقرب وقت ممكن أو مباشرة بعد التلطيخ لتجنب أو تقليل التغييرات المحتملة الناجمة عن التدهور المستمر للعينات. بالنسبة للثقافة المباشرة وثقافة التعرض المباشر ، قم بتصوير وتقييم نوعين من الخلايا.
أولا، الخلايا الموجودة على العينات في اتصال مباشر مع العينات، وثانيا، التصقت الخلايا على صفيحة البئر المحيطة بالعينات في اتصال مباشر مع العينات كما هو موضح في الشكل. بالنسبة لثقافة التعرض، كما هو موضح هنا، استخدم دليل الصور عند التقاط صور التألق للخلايا لتحديد ما إذا كانت استجابة الخلية ستكون مختلفة استجابة لتدرج التدهور الديناميكي للعينات. صورة وتحليل الخلايا الموجودة في المنطقة داخل الحلقة الداخلية ، على بعد 3.5 مم من المركز ، والحلقة الخارجية ، التي تبعد 7 مم عن المركز بشكل منفصل.
لكل عينة، وأثناء وجودها في لوحات الاستزراع، التقط عشوائيا خمس صور على الأقل من كل منطقة ذات أهمية حيث تكون الخلايا إما على اتصال غير مباشر أو اتصال غير مباشر مع العينات على مسافة محددة مسبقا. من جميع صور الخلايا التي تم الحصول عليها من الخطوة 4.3 ، قم بقياس مورفولوجيا الخلية عن طريق قياس مساحة انتشار الخلية ونسبة العرض إلى الارتفاع لتحليل الصورة. احسب عدد الخلايا في كل منطقة صورة.
احسب كثافة التصاق الخلية تحت ظروف التلامس المباشر وغير المباشر كعدد الخلايا لكل وحدة مساحة. تحليلات ما بعد الثقافة لوسائل الإعلام والعينات. قبل التثبيت الذاتي ، اجمع وسائط ما بعد الثقافة.
قم بقياس قيم الأس الهيدروجيني لوسائط ما بعد الزراعة في كل بئر مباشرة بعد الجمع باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني المعاير مسبقا. بعد الخطوة السابقة لقياس الأس الهيدروجيني ، قم بجمع الوسائط وتخفيفها باستخدام عامل تخفيف مرغوب فيه لإجراء قياسات مثالية لتركيزات الأيونات. قياس تركيزات الأيونات ذات الأهمية في وسائط ما بعد الاستزراع باستخدام مطياف انبعاث البلازما البصري المقترن بالحث والمختصر باسم ICP-OES.
بعد دراسة الخلايا المخبرية ، قد تتغير العينات القابلة للتحلل الحيوي في الأبعاد والكتلة ومورفولوجيا السطح والبنية المجهرية والتكوين. يساعد تحليل العينات بعد الزراعة على فهم آلية تدهور العينات. بعد زراعة الخلايا ، التقط صورا فوتوغرافية للعينات لإظهار التغييرات المحتملة في أبعاد العينة واللون والمورفولوجيا والخصائص المرئية الأخرى.
تجفيف أو تجفيف عينات ما بعد الزراعة وقياس كتلة العينة وبعدها وحجمها لتحديد أي تغييرات في الكتلة والبعد والحجم. استخدم المجهر الإلكتروني الماسح لتوصيف البنية المجهرية ومورفولوجيا العينات. استخدم التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة وانكسار الأشعة السينية لتوصيف تكوين ومرحلة نواتج التحلل على العينات.
استخدم FTIR أو ATR للكشف عن الترابط الكيميائي على أسطح العينات. النتائج التمثيلية. هنا ، يوضح الشكل صور التألق التمثيلية للخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم تحت ظروف اتصال مباشرة وغير مباشرة باستخدام طرق استزراع مختلفة.
يوضح هذا الشكل بيانات المثال لكثافة التصاق الخلايا الكمية. كما هو موضح في الشكل A ، في ثقافة التعرض المباشر على مدار 24 ساعة ، فإن BMSCs على اتصال مباشر مع ZC21 لديها كثافة التصاق خلوي أكبر بكثير من أي مجموعة أخرى. كما هو موضح في الشكل B ، في حالة الاتصال غير المباشر لثقافة التعرض المباشر ، تكون كثافة التصاق BMSC أعلى بكثير لمجموعة ZC21 من مجموعة المغنيسيوم.
ومع ذلك ، فإنه لا يظهر أي فرق كبير مقارنة مع T64 والخلايا فقط مجموعات التحكم. هنا ، يوضح الشكل A قيمة الأس الهيدروجيني لوسائط ما بعد الثقافة بعد ثقافة التعرض المباشر والثقافة المباشرة. بالنسبة لثقافة التعرض المباشر ، تتراوح قيم الرقم الهيدروجيني للوسائط من 8.3 إلى 8.4 لجميع العينات.
في الثقافة المباشرة ، تتراوح قيم الأس الهيدروجيني للوسائط من 7.9 إلى 8 عبر المجموعات. ويبين الشكل باء تركيز أيون المغنيسيوم في وسائط ما بعد الثقافة. في كل من ثقافة التعرض المباشر والثقافة المباشرة ، تكون تركيزات أيون المغنيسيوم في مجموعات ZC21 والمغنيسيوم أعلى بكثير من أي مجموعات تحكم أخرى.
يوضح هذا الشكل أنماط XRD ل ZSr41 والمغنيسيوم النقي بعد ثقافة التعرض لمدة ثلاثة أيام. لوحظت المراحل البلورية للتركيبات المختلفة ، مثل المغنيسيوم وأكسيد الزنك والهيدروكسيباتيت. هنا ، يوضح الشكل A تراكب صور SEM وخرائط EDX لتكوين العناصر السطحية للمغنيسيوم المطلي بأكسيد المغنيسيوم ، والتحكم في ركائز المغنيسيوم والزجاج بعد 24 ساعة من الثقافة المباشرة باستخدام BMSCs.
ويبين الشكل باء التركيب الكمي للعناصر السطحية لأسطح العينة، مما يشير إلى الترسبات المختلفة التي تشكلت أثناء زراعة الخلايا. الاستنتاجات. في هذا الفيديو ، قدمنا ثلاث طرق مختلفة في المختبر لتقييم التوافق الخلوي لمواد الزرع القابلة للتحلل الحيوي بناء على تصميمات تجريبية مختلفة وتطبيقات مقصودة. يمكن التحقيق في التفاعلات بين المواد وأنواع مختلفة من الخلايا من خلال طريقة الاستزراع المباشر وطريقة ثقافة التعرض المباشر وطريقة ثقافة التعرض.
قدم هذا الفيديو طرقا رئيسية في المختبر لدراسة تأثير المواد القابلة للتحلل الحيوي إلى جانب منتجات التحلل الخاصة بها على سلوكيات الخلايا لمجموعة متنوعة من تطبيقات الزرع الطبية.
