שיטות תרבות ישירות ועקיפות לחקר חומרי שתל מתכלים במבחנה. במהלך העשורים האחרונים, חומרים מתכלים נחקרו בהרחבה עבור יישומים ביו-רפואיים, כגון שתלים אורתופדיים, שיניים, ו maxillofacial גולגולתי. כדי לסנן את החומרים המתכלים עבור יישומים ביו-רפואיים, יש צורך להעריך חומרים אלה במונחים של תגובות תא במבחנה, ציטוקיאציות, ו ציטוטוקסיות.
תקנים בארגון הבינלאומי לתקנות נוצלו באופן נרחב בהערכות של ביו-חומרים. עם זאת, רוב תקני ISO נקבעו במקור כדי להעריך את רעילות הסגנון של חומרים שאינם מתפרקים, ובכך לספק ערך מוגבל לסינון חומרים מתכלים. בסרטון זה נציג ונדון בשלוש שיטות תרבות שונות, כלומר, שיטת תרבות ישירה, שיטת תרבות חשיפה ישירה ושיטת תרבות חשיפה להערכת תאימות במבחנה של חומרי שתל מתכלים מתכלים.
באופן ספציפי, שיטת התרבות הישירה מעריכה את האינטראקציות בין תאים חדשים שנזרעו לבין השתלים. תרבית חשיפה ישירה מחקה את האינטראקציות בין התאים שנקבעו בגוף לבין השתלים. תרבות החשיפה מאפיינת את האינטראקציות בין תאים מבוססים לבין השתלים כאשר הם אינם נמצאים במגע ישיר זה עם זה אלא באותה סביבה שבה החומרים מתפרקים.
וידאו זה מספק דוגמאות לשימוש בשלוש שיטות תרבית אלה לחקר הציטוטיות במבחנה של חומרי שתל מתכלים והאינטראקציות שלהם עם תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם. שיטות הפריה חוץ גופית המתוארות בסרטון זה מחקות תרחישים שונים של סביבת in vivo, ומרחיבות את הישימות והרלוונטיות של בדיקת ה- vitro cytocompatibility של חומרים שונים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים. אנו פועלים על פי פרוטוקול שאושר על ידי הקהילה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה בריברסייד לקצירת תאים ורקמות.
הכנה לתרבות תאים. שלוש שיטות התרבות המתוארות בסרטון זה ישימות בדרך כלל עבור סוגי תאים שונים התומכים. כאן, BMSCs שנקטפו מגמילה חולדה יוצגו כדוגמה להכנת תרבית תאים קצירת תאי גזע mesenchymal נגזר מח עצם מגמילה חולדה.
הדיאגרמה הסכמטית באיור זה מציגה את השלבים לקציר BMSCs מגמילה מעכברושים. הסר את העור והשרירים ורקמות החיבור כדי לנתח את עצם הירך מתוך החולדה המתת חסד. מניחים את עצמות הירך בצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל מדיה תרבית התא.
מניחים את הצינורות החרוטיים על קרח עד למועד ביצוע חילוץ התא. מעבירים את העצמות לצלחת פטרי בארון הבטיחות הביולוגי. חותכים את קצות העצם באמצעות להב כירורגי ולשטוף את מוח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל על ידי שטיפת חלל מח העצם עם מדיה תרבית התא באמצעות מזרק עם מחט 25 1/2 מד.
סנן את מתלי התא באמצעות מסנן 70 מיקרומטר ואחריו צנטריפוגה ב 126 פעמים כוח המשיכה במשך חמש דקות כדי לקבל את כדורי התא לשאוף החוצה מדיה supernatant ולחדש עם 10 מ"ל של מדיה טרייה. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי resuspend התאים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. פיפטה המתלה ישירות בחלק התחתון הפנימי של בקבוקון T-75 ולהוסיף מדיה כדי להביא את עוצמת הקול עד 25 מיליליטר.
תרבית את התאים באינקובטור בסביבת תרבית תאים סטרילית סטנדרטית שהיא 37 מעלות צלזיוס, אטמוספרה לחה עם 5% פחמן דו חמצני ו -95% אוויר. לאחר שלושה עד שבעה ימים, לשטוף את התאים שאינם דבקים על ידי שאיפה התקשורת הישנה וחידוש עם מדיה טרייה. המשך לטפח ולהאכיל את התאים במדיה טרייה עד שיהיו מוכנים למעבר תאים, הקפאה או שימוש בניסוי.
הכנת דגימה ועיקור. לחטא או לחטא את כל הדגימות לפני תרבית התא. שיטות עיקור או חיטוי לסוגי מדגם שונים משתנות בהתאם למאפיינים השונים של החומרים.
באופן כללי, השתמש בקרינה אולטרה סגולה כדי לחטא מתכות מתכלות למחקרי הפריה חוץ גופית. שיטות תרבית תאים. הדיאגרמה הסכמטית באיור זה מציגה את שלבי שיטת התרבות הישירה.
בסרטון זה BMSCs היו תרבותיים על צלחת נגזרת מגנזיום להציב בתוך הבארות של צלחת 12-well-תרבות רקמות מטופלים כדוגמה כדי להמחיש את שיטת התרבות. השתמש בקבוקון 90%confluent כדי לקבוע את ריכוז התא בהשעיית התא באמצעות hemocytometer. לדלל את ההשעיה התא באמצעות מדיה טרייה לריכוז התא שנקבע הדרוש למחקר התא במבחנה.
מניחים את הדגימות במרכז לוחות תרבית הרקמות של 12 הבארות. יש לשטוף את לוחות התרבות עם 2 מ"ל של PBS ו-2 מ"ל של DMEM ברצף כדי לכייל את הלחץ האוסמוטי בתנאים סטריליים. הוסף 3 מ"ל של השעיית התא המדולל לתוך כל באר על דגימות של עניין.
תרבית התאים באינקובטור בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות. הדיאגרמה הסכמטית ב- disfigure מציגה את השלבים של תרבות החשיפה הישירה. הכן את השעיית התא עם הריכוזים הנדרשים של תאים המבוססים על העיצוב הניסיוני עבור סוגי תאים שונים ויישומים מיועדים.
יש לשטוף את לוחות התרבות עם 2 מ"ל של PBS ו-2 מ"ל של DMEM ברצף כדי לכייל את הלחץ האוסמוטי בתנאים סטריליים. הוסף 3 מ"ל של השעיית התא המדולל לתוך כל באר. תרבית התאים באינקובטור הלח בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות או עד שהתאים מגיעים ל-50%-80% מפגש.
לאחר 24 שעות לשטוף, התאים בצלחת הבאר עם PBS באמצעות פיפטה כדי להסיר תאים מתים צפים. מניחים את הדגימות המחוטאות או המעוקרות ישירות על התאים הדבוקים. הוסיפו 3 מ"ל של מדיה טרייה לכל באר.
תרבית את התאים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות נוספות. הדיאגרמה הסכמטית באיור זה מציגה את שלבי שיטת תרבות החשיפה. שלבים ראשוניים להכנת תאים זהים לתרבות החשיפה הישירה.
לאחר מכן, מניחים את הדגימות בבאר מוסיף עם גודל נקבובית קרום של 0.4 מיקרומטר ומניחים את הבאר מוסיף עם הדגימות לתוך כל באר עם התאים. תרבית את התאים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות נוספות. אפיון פוסט-תרבותי של תאים.
לתרבות ישירה ותרבית חשיפה ישירה, לתקן, כתם, תמונה ולנתח את התאים דבקים הן בלוחות והן בדגימות. לתרבות החשיפה, נתחו את התאים שנדבקו ללוחות הבאר. לאסוף את מדיה תרבות פוסט מכל באר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המתאים לניתוח נוסף.
לאסוף את כל הדגימות לאחר התרבות לניתוח נוסף. לשטוף את התאים דבק על שתי דגימות וצלחות היטב שלוש פעמים באמצעות PBS. מוסיפים 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde לתוך כל צלחת באר.
שים את המכסה בחזרה על צלחת הבאר ולאפשר PFA להגיב במשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, לשאוף PFA ולחלק אותו לתוך בקבוק פסולת. לשטוף את צלחת הבאר שלוש פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את PFA ולהעביר את הפסולת לבקבוק הפסולת.
הכן את מלאי העבודה של סוכני הכתמים בהתאם להוראות היצרן. הוסף 200 עד 400 מיקרוליטרים של סוכן מכתים אלקסה פלואור 488 פאלואידין מדולל לכל באר כדי לכסות את התאים על צלחת הבאר ואת המדגם. לעטוף את צלחת הבאר בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור ולאפשר Alexa Fluor 488 Phalloidin להגיב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאסוף את Alexa פלואור 488 Phalloidin מכתים סוכן ולחלק אותו לתוך בקבוק הפסולת המתאים. לשטוף את לוחות הקיר שלוש פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את עודף Alexa Fluor 488 Phalloidin ולחלק את PBS בשימוש לתוך בקבוק הפסולת המתאים. הוסף 200 עד 400 מיקרוליטרים של DAPI מדולל לכל באר כדי לכסות את התאים בבאר ועל המדגם.
לעטוף את צלחת הבאר בנייר אלומיניום ולאפשר DAPI להגיב במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את צלחת הבאר שלוש פעמים באמצעות PBS ולחלק את ה-PBS המשומש לבקבוק הפסולת המתאים. לאחר ההכתמה, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
במידת האפשר, צלמו תמונות ניגודיות פאזה של תאים בנוסף לתמונות פלואורסצנטיות. דמיינו את התאים על הדגימות המתכלות בהקדם האפשרי או מיד לאחר ההכתמה כדי למנוע או להפחית שינויים אפשריים הנגרמים על ידי השפלה מתמשכת של דגימות. עבור תרבות ישירה ותרבות חשיפה ישירה, דמיינו והעריכו שני סוגים של תאים.
אחד, התאים על הדגימות במגע ישיר עם הדגימות, ושנית, התאים דבקו על צלחת הבאר המקיפה את הדגימות במגע ישיר עם הדגימות כפי שמוצג באיור. לתרבות חשיפה, כפי שמוצג כאן, השתמש במדריך התמונה בעת צילום תמונות הפלואורסצנטיות של תאים כדי לקבוע אם תגובת התא תהיה שונה בתגובה למעבר הדרגתי של השפלה דינמית של הדגימות. תמונה ומנתח תאים הממוקמים באזור בתוך הטבעת הפנימית, במרחק של 3.5 מ"מ מהמרכז, והטבעת החיצונית, הנמצאת במרחק של 7 מ"מ מהמרכז בנפרד.
עבור כל דגימה, ובעוד בלוחות התרבות, באופן אקראי לקחת לפחות חמש תמונות מכל אזור עניין שבו התאים הם מגע עקיף או מגע עקיף עם הדגימות במרחק מוגדר מראש. מכל תמונות התאים המתקבלות משלב 4.3, לכמת את מורפולוגיה התא על ידי מדידת אזור התפשטות התא ויחס הרוחב-גובה לניתוח תמונה. ספור את מספר התאים בכל אזור תמונה.
חשב את צפיפות ההדבקה בתא בתנאי מגע ישירים ועקיפים כמספר התאים ליחידת שטח. ניתוחים פוסט-תרבותיים של מדיה ודגימות. לפני קיבעון עצמי, לאסוף את המדיה שלאחר התרבות.
מדוד את ערכי ה- pH של המדיה הפוסט-תרבותית בכל באר מיד לאחר האיסוף באמצעות מד pH מכויל מראש. בעקבות השלב הקודם של מדידת pH, לאסוף ולדלל את המדיה באמצעות גורם דילול רצוי למדידות אופטימליות של ריכוזי יונים. למדוד את הריכוזים של יונים של עניין בתקשורת תרבות פוסט באמצעות ספקטרומטר פליטת פלזמה אופטית מצמידה אינדוקטיבית מקוצר כמו ICP-OES.
לאחר מחקר תאי הפריה חוץ גופית, הדגימות המתכלות עשויות להשתנות בממד, במסה, במורפולוגיה של פני השטח, במיקרו-מבנה ובהרכב. ניתוח פוסט-תרבותי של דגימות מסייע להבין את מנגנון ההשפלה של דגימות. לאחר תרבית התא, צלם את תצלומי הדגימות כדי להציג שינויים אפשריים בממד המדגם, בצבע, במורפולוגיה ובמאפיינים גלויים אחרים.
יבש או ייבש את דגימות הפוסט-תרבותיות ומדוד את מסת המדגם, הממד והנפח כדי לכמת כל שינוי במסה, בממד ובנפח. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לאפיין את המיקרו-מבנה והמורפולוגיה של הדגימות. השתמש ספקטרוסקופיית רנטגן פיזור אנרגיה והורדת קרני רנטגן כדי לאפיין את ההרכב והשלב של מוצרי השפלה על הדגימות.
השתמש FTIR או ATR כדי לזהות את מליטה כימית על משטחי מדגם. תוצאות מייצגות. כאן, הדמות מציגה את תמונות הפלואורסצנטיות הייצוגיות של תאי גזע שמקורם במח העצם בתנאי מגע ישירים ועקיפים בשיטות תרבות שונות.
איור זה מציג את הנתונים לדוגמה עבור צפיפות הידבקות תאים מכמתת. כפי שניתן לראות באיור A, בתרבית החשיפה הישירה של 24 שעות, BMSCs במגע ישיר עם ZC21 יש צפיפות הידבקות תאים גדולה באופן משמעותי יותר מכל קבוצה אחרת. כפי שניתן לראות באיור B, בתנאי המגע העקיף של תרבות החשיפה הישירה, צפיפות ההידבקות של BMSC גבוהה משמעותית עבור קבוצת ZC21 מאשר קבוצת המגנזיום.
עם זאת, הוא אינו מראה הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצות הבקרה של T64 ותאים בלבד. כאן, איור A מציג את ערך ה-pH של מדיה פוסט-תרבותית לאחר תרבות החשיפה הישירה והתרבות הישירה. עבור תרבות החשיפה הישירה, ערכי ה- pH של המדיה נעים בין 8.3 ל- 8.4 עבור כל הדגימות.
בתרבות הישירה, ערכי ה-pH של המדיה נעים בין 7.9 ל-8 בין הקבוצות. איור B מציג את ריכוז היונים במגנזיום בתקשורת הפוסט-תרבותית. הן בתרבות החשיפה הישירה והן בתרבות הישירה, ריכוזי יון המגנזיום שלהם בקבוצות ZC21 ומגנזיום גבוהים משמעותית מכל קבוצות בקרה אחרות.
נתון זה מציג את דפוסי XRD עבור ZSr41 ומגנזיום טהור לאחר תרבות חשיפה של שלושה ימים. השלבים הגבישיים של קומפוזיציות שונות, כגון מגנזיום, תחמוצת אבץ, הידרוקסיאפטיט נצפו. כאן, איור A מציג את שכבת העל של תמונות SEM ומפות EDX של הרכב יסוד פני השטח עבור מגנזיום מצופה תחמוצת מגנזיום מגנזיום מגנזיום, ואת השליטה של מצעים מגנזיום וזכוכית לאחר 24 שעות של תרבות ישירה עם BMSCs.
איור B מציג את ההרכב היסודי של פני השטח הכמותיים של משטחי המדגם, המציין תצהירים שונים שנוצרו במהלך תרבית התא. מסקנות. בסרטון זה הצגנו שלוש שיטות הפריה חוץ גופית שונות להערכת הציות של חומרי שתל מתכלים המבוססים על עיצובים ניסיוניים שונים ויישומים מיועדים. ניתן לחקור את האינטראקציות בין חומרים וסוגים שונים של תאים באמצעות שיטת התרבות הישירה, שיטת תרבות החשיפה הישירה ושיטת תרבות החשיפה.
וידאו זה הציג שיטות הפריה חוץ גופית מרכזיות לחקר ההשפעה של חומרים מתכלים יחד עם מוצרי השפלה שלהם על התנהגויות תאים עבור מגוון רחב של יישומי שתל רפואי.
