Прямые и косвенные методы культивирования для изучения биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro. За последние несколько десятилетий биоразлагаемые материалы были широко исследованы для биомедицинских применений, таких как ортопедические, стоматологические и черепно-челюстно-лицевые имплантаты. Для скрининга биоразлагаемых материалов для биомедицинских применений необходимо оценить эти материалы с точки зрения клеточных реакций in vitro, цитосовместимости и цитотоксичности.
Стандарты Международной организации по стандартизации широко используются при оценке биоматериалов. Тем не менее, большинство стандартов ИСО были первоначально установлены для оценки токсичности стиля неразлагаемых материалов, что обеспечивает ограниченную ценность для скрининга биоразлагаемых материалов. В этом видео мы представим и обсудим три различных метода культивирования, а именно: метод прямого культивирования, метод культуры прямого воздействия и метод культуры воздействия для оценки цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro.
В частности, метод прямой культивирования оценивает взаимодействие между вновь засеянными клетками и имплантатами. Культура прямого воздействия имитирует взаимодействие между установленными клетками в организме и имплантатами. Культура воздействия характеризует взаимодействия между установленными клетками и имплантатами, когда они находятся не в непосредственном контакте друг с другом, а в той же среде, где материалы разлагаются.
В этом видео приведены примеры использования этих трех методов культивирования для изучения цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro и их взаимодействия с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга. Методы in vitro, описанные в этом видео, имитируют различные сценарии среды in vivo, расширяя применимость и актуальность тестирования цитосовместимости in vitro различных материалов для различных биомедицинских применений. Мы следуем протоколу, одобренному Институциональным сообществом по уходу за животными и их использованию в Калифорнийском университете в Риверсайде для сбора клеток и тканей.
Подготовка клеточной культуры. Три метода культивирования, описанные в этом видео, обычно применимы для различных типов клеток, которые являются адгезивными. Здесь BMSCs, собранные из крыс,отъемышей, будут представлены в качестве примера для подготовки клеточной культуры Сбор мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, из крысиных отъемов.
Принципиальная схема на этом рисунке показывает шаги по сбору BMSC от отъемов крыс. Удалите кожу, мышечные и соединительные ткани, чтобы рассечь бедренную кость от усыпленной крысы. Поместите бедренные кости в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую клеточные питательные среды.
Поместите конические трубки на лед до момента выполнения извлечения клеток. Переложите кости на чашку Петри в шкаф биологической безопасности. Отрежьте концы кости хирургическим лезвием и промойте костный мозг в коническую трубку объемом 50 мл, промыв полость костного мозга клеточной культуральной средой с помощью шприца с иглой 25 1/2 калибра.
Фильтруйте клеточную суспензию с помощью 70-микрометрового фильтра с последующим центрифугированием при 126-кратной гравитации в течение пяти минут, чтобы получить гранулы ячейки аспирата из супернатантной среды и пополнить 10 мл свежей среды. Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать клетки, используя серологическую пипетку 10 мл. Пипетка подвески непосредственно на внутреннее дно колбы Т-75 и добавление среды для доведения объема до 25 миллилитров.
Культивируйте клетки в инкубаторе в стандартной стерильной среде клеточной культуры, которая составляет 37 градусов цельсия, увлажненной атмосфере с 5% углекислого газа и 95% воздуха. Через три-семь дней смойте неадгезивные клетки, стремясь к старым носителям и пополняя их свежими. Продолжайте культивировать и кормить клетки свежими средами, пока они не будут готовы к прохождению клеток, замораживанию или использованию в эксперименте.
Пробоподготовка и стерилизация. Стерилизуйте или дезинфицируйте все образцы перед посевом клеток. Методы стерилизации или дезинфекции для различных типов образцов варьируются в зависимости от различных свойств материалов.
В общем, используйте ультрафиолетовое излучение для дезинфекции биоразлагаемых металлов для исследований in vitro. Методы культивирования клеток. На принципиальной схеме на этом рисунке показаны этапы метода прямого языка и региональных параметров.
В этом видео BMSC культивировали на пластине, полученной из магния, помещенной внутри лунок 12-луночной пластины, обработанной тканевой культурой, в качестве примера для иллюстрации метода культивирования. Используйте 90% сливающуюся колбу для определения концентрации клеток в клеточной суспензии с помощью гемоцитометра. Разбавьте клеточную суспензию с помощью свежих сред до предписанной клеточной концентрации, необходимой для исследования клеток in vitro.
Поместите образцы в центр 12-луночных тканевых культуральных пластин. Промывайте культуральные пластины 2 мл PBS и 2 мл DMEM последовательно, чтобы откалибровать осмотическое давление в стерильных условиях. Добавьте 3 мл разбавленной клеточной суспензии в каждую лунку на интересующие образцы.
Культивируйте клетки в инкубаторе в стандартных условиях культивирования клеток в течение 24 часов. Принципиальная схема в обезображивании показывает этапы культуры прямого воздействия. Готовят клеточную суспензию с требуемыми концентрациями клеток на основе экспериментальной конструкции для различных типов клеток и предполагаемых применений.
Промывайте культуральные пластины 2 мл PBS и 2 мл DMEM последовательно, чтобы откалибровать осмотическое давление в стерильных условиях. Добавьте 3 мл разбавленной клеточной суспензии в каждую лунку. Культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе в стандартных условиях клеточной культуры в течение 24 часов или до тех пор, пока клетки не достигнут слияния от 50% до 80%.
Через 24 часа промыть клетки в колодце с помощью PBS с помощью пипетки для удаления плавающих мертвых клеток. Поместите продезинфицированные или стерилизованные образцы непосредственно на приклеенные клетки. Добавьте 3 мл свежих сред в каждую лунку.
Культивируйте клетки в стандартных условиях культивирования клеток в течение еще 24 часов. Принципиальная схема на этом рисунке показывает этапы метода культуры воздействия. Начальные этапы подготовки клеток такие же, как и при прямом воздействии культуры.
После этого поместите образцы в скважинные вставки с размером мембранных пор 0,4 микрометра и поместите вкладыши скважины с образцами в каждую скважину с ячейками. Культивируйте клетки в стандартных условиях культивирования клеток в течение еще 24 часов. Посткультурная характеристика клеток.
Для прямой культуры и культуры прямого воздействия фиксируйте, окрашивайте, изображайте и анализируйте клетки, адгезивные как на пластинах скважин, так и на образцах. Для воздействия культуры, проанализируйте клетки, приклеенные к плитам лунки. Соберите посткультурную среду из каждой скважины в соответствующую коническую трубку объемом 15 мл для дальнейшего анализа.
Соберите все образцы после посева для дальнейшего анализа. Промыть клетки, прилипшие как к образцам, так и к пластинам колодца три раза, используя PBS. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида в каждую пластину скважины.
Положите крышку обратно на пластину скважины и дайте PFA вступить в реакцию в течение 20 минут. Через 20 минут аспирируйте PFA и раздайте его в бутылку для отходов. Промойте пластину колодца три раза, используя PBS, чтобы удалить PFA и перенести отходы в бутылку для отходов.
Подготовьте рабочие запасы окрашивающих агентов в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте от 200 до 400 микролитров разбавленного красителя Alexa Fluor 488 Phalloidin в каждую лунку, чтобы покрыть клетки на пластине скважины и образец. Оберните пластину колодца в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить воздействие света и позволить фаллоидину Alexa Fluor 488 реагировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
Соберите краситель Alexa Fluor 488 Phalloidin и поместите его в соответствующую бутылку для отходов. Промойте настенные пластины три раза, используя PBS, чтобы удалить избыток фаллоидина Alexa Fluor 488 и распределите использованный PBS в соответствующую бутылку для отходов. Добавьте от 200 до 400 микролитров разбавленного DAPI в каждую лунку, чтобы покрыть ячейки в лунке и на образце.
Оберните пластину скважины в алюминиевую фольгу и дайте DAPI вступить в реакцию в течение пяти минут при комнатной температуре. Промыть пластину колодца три раза с помощью PBS и распределить использованный PBS в соответствующую бутылку для отходов. После окрашивания визуализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа.
По возможности делайте фазоконтрастные изображения клеток в дополнение к флуоресцентным изображениям. Визуализируйте клетки на биоразлагаемых образцах как можно скорее или сразу после окрашивания, чтобы избежать или уменьшить возможные изменения, вызванные непрерывной деградацией образцов. Для прямой культуры и культуры прямого воздействия изобразите и оцените два типа клеток.
Во-первых, клетки на образцах в непосредственном контакте с образцами, а во-вторых, клетки прилипали к пластине скважины, окружающей образцы, в прямом контакте с образцами, как показано на рисунке. Для культуры экспозиции, как показано здесь, используйте руководство по изображению при получении флуоресцентных изображений клеток, чтобы определить, будет ли реакция клетки отличаться в ответ на динамический градиент деградации образцов. Изображение и анализ клеток, расположенных в области внутри внутреннего кольца, на расстоянии 3,5 мм от центра, и внешнего кольца, которое находится на расстоянии 7 мм от центра отдельно.
Для каждого образца, а также во время нахождения в культуральных пластинах случайным образом сделать по меньшей мере пять изображений из каждой интересующей области, где клетки находятся либо в косвенном контакте, либо в косвенном контакте с образцами на заранее определенном расстоянии. Из всех изображений клеток, полученных на этапе 4.3, количественно оцените морфологию ячейки, измерив площадь распространения ячеек и соотношение сторон для анализа изображения. Подсчитайте количество ячеек в каждой области изображения.
Рассчитайте плотность адгезии ячеек в условиях прямого и косвенного контакта как количество ячеек на единицу площади. Посткультурный анализ медиа и образцов. Прежде чем самостоятельно зацикливаться, соберите посткультурные медиа.
Измерьте значения pH посткультурной среды в каждой скважине сразу после сбора с помощью предварительно калиброванного рН-метра. После предыдущего этапа измерения pH собирают и разбавляют среду, используя желаемый коэффициент разрежения для оптимальных измерений концентраций ионов. Измерьте концентрации интересующих ионов в посткультурных средах с помощью индуктивно связанного плазменно-оптического эмиссионного спектрометра, сокращенно ICP-OES.
После исследования клеток in vitro биоразлагаемые образцы могут измениться по размеру, массе, морфологии поверхности, микроструктуре и составу. Посткультурный анализ образцов помогает понять механизм деградации образцов. После культивирования клеток сделайте фотографии образцов, чтобы показать возможные изменения в размерах образца, цвете, морфологии и других видимых характеристиках.
Высушите или обезвоживание образцов посткультуры и измерьте массу, размер и объем образца для количественной оценки любых изменений в массе, размерах и объеме. Используйте сканирующий электронный микроскоп для характеристики микроструктуры и морфологии образцов. Используйте энергодисперсионную рентгеновскую спектроскопию и рентгеновскую дефракцию для характеристики состава и фазы продуктов деградации на образцах.
Используйте FTIR или ATR для обнаружения химической связи на поверхностях образцов. Репрезентативные результаты. Здесь на рисунке показаны репрезентативные флуоресцентные изображения стволовых клеток, полученных из костного мозга, в условиях прямого и косвенного контакта с использованием различных методов культивирования.
На этом рисунке показан пример данных для количественной плотности адгезии клеток. Как показано на рисунке А, в 24-часовой культуре прямого воздействия BMSC, находящиеся в прямом контакте с ZC21, имеют значительно большую плотность адгезии клеток, чем любая другая группа. Как показано на рисунке В, в условиях косвенного контакта культуры прямого воздействия плотность адгезии BMSC значительно выше для группы ZC21, чем для группы магния.
Тем не менее, он не показывает существенной разницы по сравнению с T64 и клетками только контрольных групп. Здесь на рисунке А показано значение рН посткультурных медиа после культуры прямого воздействия и прямой культуры. Для культуры прямого воздействия значения pH среды колеблются от 8,3 до 8,4 для всех образцов.
В прямой культуре значения pH сред варьируются от 7,9 до 8 в группах. На рисунке B показана концентрация ионов магния в посткультурных средах. Как в культуре прямого воздействия, так и в культуре прямого воздействия их концентрации ионов магния в группах ZC21 и магния значительно выше, чем в любых других контрольных группах.
На этом рисунке показаны паттерны XRD для ZSr41 и чистого магния после трехдневной культуры воздействия. Наблюдались кристаллические фазы различного состава, такие как магний, оксид цинка и гидроксиапатит. Здесь на рисунке A показано наложение изображений SEM и карт EDX элементного состава поверхности для магния, покрытого оксидом магния, и контроль магниевых подложек и стекла после 24 часов прямого культивирования с помощью BMSCs.
На рисунке В показан количественный элементный состав поверхности образцов, указывающий на различные осаждения, образующиеся в ходе клеточной культуры. Выводы. В этом видео мы представили три различных метода in vitro для оценки цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов на основе различных экспериментальных конструкций и предполагаемых применений. Взаимодействие между материалами и различными типами клеток может быть исследовано с помощью метода прямой культуры, метода культуры прямого воздействия и метода культуры воздействия.
В этом видео представлены ключевые методы in vitro для изучения влияния биоразлагаемых материалов вместе с их продуктами деградации на поведение клеток для различных применений медицинских имплантатов.
