시험관 내에서 생분해성 임플란트 물질을 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법. 지난 수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과, 치과 및 두개골 악안면 임플란트와 같은 생물 의학 응용 분야를 위해 광범위하게 탐구되었습니다. 생분해성 물질을 생물의학 응용을 위해 스크리닝하기 위해, 시험관내 세포 반응, 세포 적합성 및 세포독성 측면에서 이들 물질을 평가할 필요가 있다.
국제 표준화기구 (International Organization for Standardization)의 표준은 생체 재료 평가에 널리 활용되었습니다. 그러나 대부분의 ISO 표준은 원래 비 분해 성 물질의 스타일 독성을 평가하기 위해 수립되었으므로 생분해 성 물질 스크리닝에 제한된 가치를 제공합니다. 이 비디오에서는 생분해성 임플란트 재료의 시험관내 세포 적합성을 평가하기 위한 세 가지 배양 방법, 즉 직접 배양 방법, 직접 노출 배양 방법 및 노출 배양 방법을 소개하고 논의합니다.
구체적으로, 직접 배양 방법은 새로 시딩된 세포와 임플란트 사이의 상호작용을 평가한다. 직접 노출 배양은 체내에서 확립된 세포와 임플란트 사이의 상호작용을 모방한다. 노출 배양은 확립 된 세포와 임플란트가 서로 직접 접촉하지 않고 재료가 분해되는 동일한 환경에서 상호 작용을 특징으로합니다.
이 비디오는 생분해성 임플란트 물질의 시험관내 세포 적합성 및 골수 유래 중간엽 줄기 세포와의 상호작용을 연구하기 위해 이러한 세 가지 배양 방법을 사용하는 예를 제공한다. 이 비디오에 설명된 시험관내 방법은 생체내 환경의 상이한 시나리오를 모방하여, 다양한 생체의학 응용을 위한 상이한 물질의 시험관내 세포적합성 시험의 적용성 및 관련성을 넓힌다. 우리는 세포 및 조직 수확을 위해 리버 사이드 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 공동체가 승인 한 프로토콜을 따릅니다.
세포 배양 준비. 이 비디오에 설명된 세 가지 배양 방법은 일반적으로 부착되는 상이한 세포 유형에 적용 가능하다. 여기서, 래트 이유식으로부터 수확된 BMSCs는 래트 이유식으로부터 골수 유래 중간엽 줄기세포를 수확하는 세포 배양 제제의 예로서 도입될 것이다.
이 그림의 개략도는 쥐 이유식에서 BMSC를 수확하는 단계를 보여줍니다. 피부와 근육 및 결합 조직을 제거하여 안락사 된 쥐에서 대퇴골을 해부하십시오. 대퇴골 뼈를 세포 배양 배지를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브에 넣는다.
세포 추출을 수행 할 때까지 얼음 위에 원뿔형 튜브를 놓습니다. 뼈를 생물학적 안전 캐비닛의 페트리 접시로 옮깁니다. 수술 블레이드를 사용하여 뼈의 끝을 자르고 25 1/2 게이지 바늘이있는 주사기를 사용하여 세포 배양 배지로 골수를 세척하여 골수를 50 mL 원뿔형 튜브로 플러시합니다.
세포 현탁액을 70 마이크로미터 필터를 사용하여 여과한 다음, 5분 동안 126배 중력에서 원심분리하여 세포 펠릿 흡인물을 상청액 배지 밖으로 꺼내고 10 mL의 신선한 배지로 보충한다. 부드럽게 위아래로 피펫하여 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 재현탁시켰다. 서스펜션을 T-75 플라스크의 내부 바닥에 직접 피펫하고 매체를 추가하여 최대 25 밀리리터의 부피를 가져옵니다.
세포를 섭씨 37도, 가습 분위기 5%이산화탄소 및 95%공기의 표준 멸균 세포 배양 환경에서 배양기에서 배양한다. 사흘에서 칠일 후, 오래된 배지를 열망하고 신선한 배지로 보충하여 부착되지 않은 세포를 헹구십시오. 세포 통과, 동결 또는 실험에 사용할 준비가 될 때까지 세포를 새로운 배지로 계속 배양하고 먹이십시오.
샘플 준비 및 살균. 세포 배양 전에 모든 샘플을 멸균하거나 소독하십시오. 다른 샘플 유형에 대한 살균 또는 소독 방법은 재료의 다른 특성에 따라 다릅니다.
일반적으로 자외선을 사용하여 시험관 내 연구를 위해 생분해 성 금속을 소독하십시오. 세포 배양 방법. 이 그림의 개략도는 직접 배양 방법의 단계를 보여줍니다.
본 비디오에서 BMSCs는 배양방법을 예시하기 위한 예로서 12-웰 조직 배양 처리된 플레이트의 웰 내부에 놓인 마그네슘 유래 플레이트 상에서 배양되었다. 90%confluent 플라스크를 사용하여 혈구분석기를 사용하여 세포 현탁액 중의 세포 농도를 결정한다. 신선한 배지를 사용하여 세포 현탁액을 시험관 내에서 세포 연구에 필요한 처방 된 세포 농도로 희석하십시오.
샘플을 12-웰 조직-배양 플레이트의 중앙에 놓는다. 배양 플레이트를 PBS 2 mL 및 DMEM 2 mL로 순차적으로 헹구어 멸균 조건하에서 삼투압을 교정한다. 희석된 세포 현탁액 3 mL를 각 웰에 관심 있는 샘플 상에 첨가한다.
세포를 표준 세포 배양 조건 하에서 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. disfigure의 개략도는 직접 노출 배양의 단계를 보여줍니다. 다양한 세포 유형 및 의도된 적용에 대한 실험 설계에 기초하여 필요한 농도의 세포로 세포 현탁액을 준비한다.
배양 플레이트를 PBS 2 mL 및 DMEM 2 mL로 순차적으로 헹구어 멸균 조건하에서 삼투압을 교정한다. 희석된 세포 현탁액 3 mL를 각 웰에 첨가한다. 세포를 표준 세포 배양 조건 하에서 가습 배양기에서 24시간 동안 또는 세포가 50% 내지 80%컨플루언스에 도달할 때까지 배양한다.
24시간 헹구고, PBS로 웰 플레이트에 세포를 헹구고 피펫을 이용하여 부유하는 죽은 세포를 제거하였다. 소독 또는 멸균된 샘플을 부착된 세포 위에 직접 놓는다. 각 웰에 신선한 배지 3mL를 넣습니다.
세포를 또 다른 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 배양한다. 이 도면의 개략도는 노출 배양 방법의 단계를 보여줍니다. 세포 준비를 위한 초기 단계는 직접 노출 배양과 동일하다.
그 후, 샘플을 막 기공 크기가 0.4 마이크로미터인 웰 인서트에 넣고 샘플과 함께 웰 인서트를 세포와 함께 각 웰에 배치합니다. 세포를 또 다른 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 배양한다. 세포의 배양 후 특성화.
직접 배양 및 직접 노출 배양을 위해, 웰 플레이트 및 샘플 둘 다에 부착된 세포를 고정, 염색, 이미지 및 분석한다. 노출 배양을 위해, 웰 플레이트에 부착된 세포를 분석한다. 추가 분석을 위해 각 웰로부터 배양 후 배지를 상응하는 15 mL 원뿔형 튜브로 수집한다.
추가 분석을 위해 배양 후 모든 샘플을 수집한다. PBS를 사용하여 샘플 및 웰 플레이트 둘 다에 부착된 세포를 세 번 헹구십시오. 4% 파라포름알데히드 1mL를 각 웰 플레이트에 넣습니다.
뚜껑을 다시 웰 플레이트에 올려 놓고 PFA가 20 분 동안 반응하도록하십시오. 20 분 후에 PFA를 흡인하고 폐기물 병에 분배하십시오. PBS를 사용하여 웰 플레이트를 세 번 헹구어 PFA를 제거하고 폐기물을 폐기물 병으로 옮깁니다.
염색제의 작업 재고를 준비하십시오 제조업체의 지시에 따라. 희석된 알렉사 플루오르 488 Phalloidin 염색제 200 내지 400 마이크로리터를 각 웰에 첨가하여 웰 플레이트 및 샘플 상의 세포를 덮는다. 우물 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 빛에 노출을 방지하고 Alexa Fluor 488 Phalloidin이 실온에서 20 분 동안 반응하도록하십시오.
Alexa Fluor 488 Phalloidin 염색제를 수집하여 해당 폐기물 병에 분배하십시오. PBS를 사용하여 벽 플레이트를 세 번 헹구어 과량의 알렉사 플루오르 488 팔로이드인을 제거하고 사용된 PBS를 상응하는 폐병에 분배한다. 희석된 DAPI 200 내지 400 마이크로리터를 각 웰에 첨가하여 웰 및 샘플 상의 세포를 덮는다.
웰 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 DAPI가 실온에서 다섯 분 동안 반응하도록 하십시오. PBS를 사용하여 웰 플레이트를 세 번 헹구고 사용된 PBS를 상응하는 폐병에 분배한다. 염색 후, 형광현미경을 이용하여 세포를 이미지화하였다.
가능할 때마다 형광 이미지 외에도 세포의 위상차 이미지를 찍으십시오. 샘플을 지속적으로 분해함으로써 야기되는 가능한 변화를 피하거나 감소시키기 위해 염색 직후에 가능한 한 빨리 또는 염색 직후에 세포를 이미지화한다. 직접 배양 및 직접 노출 배양을 위해, 두 가지 유형의 세포를 이미지화하고 평가한다.
하나는, 샘플과 직접 접촉하는 샘플 상의 세포이고, 두 개는, 도면에 나타낸 바와 같이, 샘플과 직접 접촉하는 샘플을 둘러싸는 웰 플레이트 상에 부착된 세포이다. 노출 배양의 경우, 여기에 표시된 바와 같이, 세포의 형광 이미지를 촬영할 때 이미지 가이드를 사용하여 샘플의 동적 분해 구배에 대한 반응에서 세포의 반응이 다른지 여부를 결정하십시오. 중앙에서 3.5mm 떨어진 내부 링 및 중심에서 7mm 떨어진 외부 링 내의 영역에 위치한 세포를 개별적으로 이미지 및 분석합니다.
각 샘플에 대해, 그리고 배양 플레이트 내에 있는 동안, 세포가 미리 정의된 거리에서 샘플과 간접 접촉하거나 간접 접촉하는 각각의 관심 영역으로부터 적어도 다섯 개의 이미지를 랜덤하게 취한다. 단계 4.3으로부터 수득된 모든 세포 이미지로부터, 이미지 분석을 위해 세포 확산 면적 및 종횡비를 측정함으로써 세포 형태를 정량화한다. 각 이미지 영역의 셀 수를 계산합니다.
직접 및 간접 접촉 조건 하에서의 세포 부착 밀도를 단위 면적당 셀 수로 계산한다. 배지 및 샘플의 사후 배양 분석. 자기 고정 전에 포스트 컬처 미디어를 수집하십시오.
사전 보정된 pH 측정기를 사용하여 수집 직후 각 웰에서 배양 후 배지의 pH 값을 측정한다. pH 측정의 이전 단계에 따라, 이온 농도의 최적 측정을 위해 바람직한 희석 계수를 사용하여 배지를 수집하고 희석하십시오. ICP-OES로 약칭된 유도적으로 결합된 플라즈마-광학 방출 분광계를 사용하여 배양 후 배지에서 관심있는 이온의 농도를 측정한다.
시험관내 세포 연구 후, 생분해성 샘플은 치수, 질량, 표면 형태학, 미세구조 및 조성에서 변화할 수 있다. 샘플의 배양 후 분석은 샘플의 분해 메커니즘을 이해하는 데 도움이됩니다. 세포 배양 후, 샘플의 사진을 찍어 샘플 치수, 색상, 형태학 및 기타 가시적 특성의 가능한 변화를 보여줍니다.
배양 후 샘플을 건조 또는 탈수시키고 샘플 질량, 치수 및 부피를 측정하여 질량, 치수 및 부피의 변화를 정량화한다. 주사 전자 현미경을 사용하여 샘플의 미세 구조와 형태를 특성화하십시오. 에너지 분산 x선 분광법 및 x-선 굴절을 사용하여 샘플에서 분해 생성물의 조성과 위상을 특성화하십시오.
FTIR 또는 ATR을 사용하여 시료 표면에서의 화학적 결합을 검출하십시오. 대표적인 결과. 여기서, 도면은 다양한 배양방법을 이용한 직간접 접촉 조건 하에서 골수유래 줄기세포의 대표적인 형광 이미지를 나타낸 것이다.
이 도면은 정량화된 세포 부착 밀도에 대한 예시적인 데이터를 나타낸다. 도 A에 나타난 바와 같이, 24시간 직접 노출 배양에서, ZC21과 직접 접촉하는 BMSCs는 다른 어떤 그룹보다 유의하게 더 큰 세포 부착 밀도를 갖는다. 도 B에 나타난 바와 같이, 직접 노출 배양의 간접 접촉 조건에서, BMSC 부착 밀도는 마그네슘 그룹보다 ZC21 그룹에 대해 유의하게 더 높다.
그러나, 대조군만을 대상으로 한 T64 세포와 비교하여 유의한 차이는 보이지 않는다. 여기서, 도 A는 직접 노출 배양 및 직접 배양 후의 배양 후 배지의 pH 값을 나타낸다. 직접 노출 배양의 경우, 배지의 pH 값은 모든 샘플에 대해 8.3 내지 8.4 범위이다.
직접 배양에서, 배지의 pH 값은 그룹에 걸쳐 7.9 내지 8의 범위이다. 도 B는 배양 후 배지 내의 마그네슘 이온 농도를 나타낸다. 직접 노출 배양 및 직접 배양 둘 다에서, ZC21 및 마그네슘 그룹에서의 마그네슘 이온 농도는 다른 대조군보다 유의하게 높다.
이 그림은 사흘 노출 배양 후 ZSr41 및 순수 마그네슘에 대한 XRD 패턴을 보여줍니다. 마그네슘, 산화아연 및 히드록시아파타이트와 같은 상이한 조성물의 결정상이 관찰되었다. 여기서, 도 A는 산화마그네슘이 코팅된 마그네슘에 대한 표면원소 조성의 SEM 이미지 및 EDX 맵의 오버레이, BMSCs로 24시간 직접 배양한 후 마그네슘 기판과 유리의 조절을 나타낸 것이다.
도 B는 샘플 표면의 정량적 표면 원소 조성을 나타내며, 이는 세포 배양 동안 형성된 상이한 침착을 나타낸다. 결론. 이 비디오에서는 다양한 실험 설계 및 의도 된 응용 프로그램을 기반으로 생분해 성 임플란트 재료의 세포 적합성을 평가하기위한 세 가지 시험관 내 방법을 소개했습니다. 물질과 다양한 종류의 세포 간의 상호작용은 직접 배양법, 직접 노출 배양 방법 및 노출 배양 방법을 통해 조사할 수 있었다.
이 비디오는 다양한 의료용 임플란트 응용 분야의 세포 거동에 대한 분해 생성물과 함께 생분해 성 물질의 효과를 연구하는 주요 시험관 내 방법을 제시했습니다.
