Biyolojik olarak parçalanabilen implant materyallerini in vitro olarak incelemek için doğrudan ve dolaylı kültür yöntemleri. Son birkaç on yılda, biyobozunur materyaller ortopedik, dental ve kraniyal maksillofasiyal implantlar gibi biyomedikal uygulamalar için kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. biyomedikal uygulamalar için biyobozunur materyalleri taramak için, bu materyalleri in vitro hücre yanıtları, sitouyumluluk ve sitotoksisite açısından değerlendirmek gerekir.
Uluslararası Standardizasyon Örgütü'ndeki standartlar, biyomalzemelerin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, çoğu ISO standardı başlangıçta parçalanamayan malzemelerin stil toksisitesini değerlendirmek için oluşturulmuştur, böylece biyolojik olarak parçalanabilir malzemelerin taranması için sınırlı değer sağlanmaktadır. Bu videoda, biyolojik olarak parçalanabilen implant materyallerinin in vitro sitouyumluluğunu değerlendirmek için doğrudan kültür yöntemi, doğrudan maruz kalma kültürü yöntemi ve maruz kalma kültürü yöntemi olmak üzere üç farklı kültür yöntemini tanıtacak ve tartışacağız.
Spesifik olarak, doğrudan kültür yöntemi, yeni tohumlanan hücreler ve implantlar arasındaki etkileşimleri değerlendirir. Doğrudan maruz kalma kültürü, vücuttaki yerleşik hücreler ile implantlar arasındaki etkileşimleri taklit eder. Maruz kalma kültürü, yerleşik hücreler ve implantlar arasındaki etkileşimleri, birbirleriyle doğrudan temas halinde olmadıklarında, ancak malzemelerin bozunduğu aynı ortamda karakterize eder.
Bu video, biyolojik olarak parçalanabilen implant materyallerinin in vitro sitouyumluluğunu ve kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle etkileşimlerini incelemek için bu üç kültür yönteminin kullanımına örnekler sunmaktadır. Bu videoda açıklanan in vitro yöntemler, in vivo ortamın farklı senaryolarını taklit ederek, çeşitli biyomedikal uygulamalar için farklı malzemelerin in vitro sitouyumluluk testinin uygulanabilirliğini ve alaka düzeyini genişletmektedir. Hücre ve doku hasadı için Riverside'daki Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Topluluğu tarafından onaylanan bir protokolü takip ediyoruz.
Hücre kültürü hazırlama. Bu videoda açıklanan üç kültür yöntemi genellikle yapışkan farklı hücre tipleri için geçerlidir. Burada, sıçan sütten kesilenlerden toplanan BMSC'ler, hücre kültürü hazırlığı için bir örnek olarak tanıtılacaktır Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin sıçan sütten kesilmesinden toplanması.
Bu şekildeki şematik diyagram, BMSC'leri sıçan sütten kesilenlerden hasat etme adımlarını göstermektedir. Femuru ötenazi sıçandan çıkarmak için deri, kas ve bağ dokularını çıkarın. Femur kemiklerini hücre kültürü ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
Konik tüpleri, hücre ekstraksiyonu yapılana kadar buzun üzerine yerleştirin. Kemikleri biyolojik güvenlik kabinindeki bir Petri kabına aktarın. Cerrahi bir bıçak kullanarak kemiğin uçlarını kesin ve kemik iliği boşluğunu 25 1/2 gauge iğneli bir şırınga kullanarak hücre kültürü ortamıyla yıkayarak kemik iliğini 50 mL'lik bir konik tüpe yıkayın.
Hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir filtre kullanarak filtreleyin, ardından hücre peletlerini elde etmek için beş dakika boyunca 126 kat yerçekiminde santrifüjleme yapın Süpernatant ortamı aspire edin ve 10 mL taze medya ile doldurun. 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Süspansiyonu doğrudan bir T-75 şişesinin iç dibine pipetleyin ve hacmi 25 mililitreye çıkarmak için ortam ekleyin.
Bir inkübatördeki hücreleri, 37 santigrat derece olan standart steril hücre kültürü ortamında,% 5 karbondioksit ve% 95 hava ile nemlendirilmiş atmosferde kültürleyin. Üç ila yedi gün sonra, eski medyayı aspire ederek ve taze ortamla doldurarak yapışkan olmayan hücreleri durulayın. Hücre geçişine, donmaya veya bir deneyde kullanıma hazır olana kadar hücreleri taze ortamlarla kültürlemeye ve beslemeye devam edin.
Numune hazırlama ve sterilizasyon. Hücre kültüründen önce tüm örnekleri sterilize edin veya dezenfekte edin. Farklı numune tipleri için sterilizasyon veya dezenfeksiyon yöntemleri, malzemelerin farklı özelliklerine bağlı olarak değişir.
Genel olarak, in vitro çalışmalar için biyolojik olarak parçalanabilen metalleri dezenfekte etmek için ultraviyole radyasyon kullanın. Hücre kültürü yöntemleri. Bu şekildeki şematik diyagram, doğrudan kültür yönteminin adımlarını gösterir.
Bu videoda BMSC'ler, kültür yöntemini göstermek için bir örnek olarak 12 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın kuyucuklarının içine yerleştirilmiş magnezyum türevi bir plaka üzerinde kültürlenmiştir. Bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyonundaki hücre konsantrasyonunu belirlemek için% 90 akıcı bir şişe kullanın. Hücre süspansiyonunu, taze medya kullanarak, in vitro hücre çalışması için gerekli olan öngörülen bir hücre konsantrasyonuna seyreltin.
Numuneleri 12 delikli doku kültürü plakalarının ortasına yerleştirin. Ozmotik basıncı steril koşullar altında kalibre etmek için kültür plakalarını sırasıyla 2 mL PBS ve 2 mL DMEM ile durulayın. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 3 mL'sini, ilgilenilen numunelerin üzerine her bir kuyucuğa ekleyin.
Hücreleri 24 saat boyunca standart hücre kültürü koşulları altında bir inkübatörde kültürleyin. Deformdeki şematik diyagram, doğrudan maruz kalma kültürünün adımlarını gösterir. Hücre süspansiyonunu, farklı hücre tipleri ve amaçlanan uygulamalar için deneysel tasarıma dayanan gerekli hücre konsantrasyonlarıyla hazırlayın.
Ozmotik basıncı steril koşullar altında kalibre etmek için kültür plakalarını sırasıyla 2 mL PBS ve 2 mL DMEM ile durulayın. Her bir kuyucuğa seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 3 mL'sini ekleyin. Nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında 24 saat boyunca veya hücreler% 50 ila% 80 birleşmeye ulaşana kadar kültürleyin.
24 saat duruladıktan sonra, kuyu plakasındaki hücreler, yüzen ölü hücreleri çıkarmak için bir pipet kullanarak PBS ile durulayın. Dezenfekte edilmiş veya sterilize edilmiş numuneleri doğrudan yapıştırılmış hücrelerin üzerine yerleştirin. Her bir kuyucuğa 3 mL taze ortam ekleyin.
Hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında 24 saat daha kültürleyin. Bu şekildeki şematik diyagram, maruz kalma kültürü yönteminin adımlarını göstermektedir. Hücre hazırlığı için ilk adımlar doğrudan maruz kalma kültürü ile aynıdır.
Daha sonra, numuneleri membran gözenek boyutu 0,4 mikrometre olan kuyu eklerine yerleştirin ve numunelerle birlikte kuyu eklerini hücrelerle birlikte her bir kuyucuğa yerleştirin. Hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında 24 saat daha kültürleyin. Postkültür hücrelerinin karakterizasyonu.
Doğrudan kültür ve doğrudan maruz kalma kültürü için, hem kuyu plakalarına hem de numunelere yapışan hücreleri sabitleyin, lekeleyin, görüntüleyin ve analiz edin. Maruz kalma kültürü için, kuyu plakalarına yapışan hücreleri analiz edin. Daha fazla analiz için her bir kuyucuktan kültür sonrası medyayı karşılık gelen 15 mL'lik bir konik tüpe toplayın.
Daha fazla analiz için kültürden sonra tüm örnekleri toplayın. PBS kullanarak hem numunelere hem de kuyu plakalarına yapışan hücreleri üç kez durulayın. Her kuyucuk plakasına 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin.
Kapağı tekrar kuyu plakasına yerleştirin ve PFA'nın 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin. 20 dakika sonra, PFA'yı aspire edin ve bir atık şişesine dağıtın. PFA'yı çıkarmak ve atıkları atık şişesine aktarmak için PBS kullanarak kuyu plakasını üç kez durulayın.
Boyama maddelerinin çalışma stoklarını hazırlayın Üreticinin talimatlarını izleyin. Kuyu plakasındaki hücreleri ve numuneyi örtmek için her bir kuyucuğa 200 ila 400 mikrolitre seyreltilmiş Alexa Fluor 488 Phalloidin boyama maddesi ekleyin. Işığa maruz kalmayı önlemek için kuyu plakasını alüminyum folyoya sarın ve Alexa Fluor 488 Phalloidin'in oda sıcaklığında 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin.
Alexa Fluor 488 Phalloidin boyama maddesini toplayın ve ilgili atık şişesine dağıtın. Fazla Alexa Fluor 488 Falloidin'i çıkarmak için PBS kullanarak duvar plakalarını üç kez durulayın ve kullanılmış PBS'yi ilgili atık şişesine dağıtın. Kuyudaki ve numunedeki hücreleri örtmek için her bir oyuğa 200 ila 400 mikrolitre seyreltilmiş DAPI ekleyin.
Kuyu plakasını alüminyum folyoya sarın ve DAPI'nin oda sıcaklığında beş dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin. PBS kullanarak kuyu plakasını üç kez durulayın ve kullanılmış PBS'yi ilgili atık şişesine dağıtın. Boyama işleminden sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak hücreleri görüntüleyin.
Mümkün olduğunda, floresan görüntülere ek olarak hücrelerin faz kontrastlı görüntülerini alın. Biyolojik olarak parçalanabilen numunelerdeki hücreleri, numunelerin sürekli bozulmasından kaynaklanan olası değişiklikleri önlemek veya azaltmak için mümkün olan en kısa sürede veya boyamadan hemen sonra görüntüleyin. Doğrudan kültür ve doğrudan maruz kalma kültürü için, iki tip hücreyi görüntüleyin ve değerlendirin.
Birincisi, numuneler üzerindeki hücreler numunelerle doğrudan temas halindedir ve ikincisi, numuneleri çevreleyen kuyu plakasına yapışan hücreler, şekilde gösterildiği gibi numunelerle doğrudan temas halindedir. Pozlama kültürü için, burada gösterildiği gibi, hücrelerin floresan görüntülerini alırken, hücrelerin tepkisinin örneklerin dinamik bozunma gradyanına yanıt olarak farklı olup olmayacağını belirlemek için görüntü kılavuzunu kullanın. İç halka içindeki alanda, merkezden 3,5 mm uzakta bulunan hücreleri ve merkezden 7 mm uzakta olan dış halkayı ayrı ayrı görüntüler ve analiz eder.
Her numune için ve kültür plakalarındayken, hücrelerin önceden tanımlanmış bir mesafedeki numunelerle dolaylı temas veya dolaylı temas halinde olduğu her ilgi alanından rastgele en az beş görüntü alın. Adım 4.3'ten elde edilen tüm hücre görüntülerinden, görüntü analizi için hücre yayılma alanını ve en boy oranını ölçerek hücre morfolojisini ölçün. Her görüntü alanındaki hücre sayısını sayın.
Doğrudan ve dolaylı temas koşulları altında hücre yapışma yoğunluğunu, birim alan başına düşen hücre sayısı olarak hesaplayın. Medya ve örneklerin postkültür analizleri. Kendini sabitlemeden önce, postkültür medyasını toplayın.
Önceden kalibre edilmiş bir pH metre kullanarak toplama işleminden hemen sonra her bir kuyucuktaki kültür sonrası ortamın pH değerlerini ölçün. pH ölçümünün önceki adımını takiben, iyon konsantrasyonlarının optimum ölçümleri için istenen bir seyreltme faktörü kullanarak ortamı toplayın ve seyreltin. ICP-OES olarak kısaltılmış, endüktif olarak eşleşmiş plazma-optik emisyon spektrometresi kullanarak kültür sonrası medyadaki ilgili iyonların konsantrasyonlarını ölçün.
İn vitro hücre çalışmasından sonra, biyolojik olarak parçalanabilen örnekler boyut, kütle, yüzey morfolojisi, mikroyapı ve bileşimde değişebilir. Örneklerin kültür sonrası analizi, örneklerin bozunma mekanizmasını anlamaya yardımcı olur. Hücre kültüründen sonra, örnek boyutu, rengi, morfolojisi ve diğer görünür özelliklerdeki olası değişiklikleri göstermek için örneklerin fotoğraflarını çekin.
Kültür sonrası numuneleri kurutun veya kurutun ve kütle, boyut ve hacimdeki değişiklikleri ölçmek için numune kütlesini, boyutunu ve hacmini ölçün. Numunelerin mikroyapısını ve morfolojisini karakterize etmek için taramalı elektron mikroskobu kullanın. Numuneler üzerindeki bozunma ürünlerinin bileşimini ve fazını karakterize etmek için enerji dağıtıcı x-ışını spektroskopisi ve x-ışını kırıntısı kullanın.
Numune yüzeylerindeki kimyasal yapışmayı tespit etmek için FTIR veya ATR kullanın. Temsili sonuçlar. Burada şekil, kemik iliğinden türetilmiş kök hücrelerin farklı kültür yöntemleri kullanılarak doğrudan ve dolaylı temas koşulları altında temsili floresan görüntülerini göstermektedir.
Bu şekil, niceliklendirilmiş hücre adezyon yoğunluğu için örnek verileri göstermektedir. Şekil A'da gösterildiği gibi, 24 saatlik doğrudan maruz kalma kültüründe, ZC21 ile doğrudan temas halinde olan BMSC'ler, diğer gruplardan önemli ölçüde daha fazla hücre yapışma yoğunluğuna sahiptir. Şekil B'de gösterildiği gibi, doğrudan maruz kalma kültürünün dolaylı temas durumunda, BMSC adezyon yoğunluğu, ZC21 grubu için magnezyum grubundan anlamlı derecede daha yüksektir.
Bununla birlikte, T64 ile karşılaştırıldığında anlamlı bir fark göstermez ve hücreler sadece kontrol gruplarıdır. Burada, Şekil A, doğrudan maruz kalma kültürü ve doğrudan kültürden sonra postkültür ortamının pH değerini göstermektedir. Doğrudan maruz kalma kültürü için, ortamın pH değerleri tüm numuneler için 8,3 ila 8,4 arasında değişir.
Doğrudan kültürde, ortamın pH değerleri gruplar arasında 7,9 ila 8 arasında değişmektedir. Şekil B, postkültür ortamındaki magnezyum iyon konsantrasyonunu göstermektedir. Hem doğrudan maruz kalma kültüründe hem de doğrudan kültürde, ZC21 ve magnezyum gruplarındaki magnezyum iyon konsantrasyonları diğer kontrol gruplarından önemli ölçüde daha yüksektir.
Bu şekil, üç günlük bir maruz kalma kültüründen sonra ZSr41 ve saf magnezyum için XRD modellerini göstermektedir. Magnezyum, çinko oksit ve hidroksiapatit gibi farklı bileşimlerin kristalin fazları gözlendi. Burada, Şekil A, SEM görüntülerinin bindirmesini ve magnezyum oksit kaplı magnezyum için yüzey elemental bileşiminin EDX haritalarını ve BMSC'lerle 24 saatlik doğrudan kültürden sonra magnezyum substratlarının ve camın kontrolünü göstermektedir.
Şekil B, numune yüzeylerinin kantitatif yüzey element bileşimini göstererek, hücre kültürü sırasında oluşan farklı birikimleri göstermektedir. Sonuç. Bu videoda, biyolojik olarak parçalanabilen implant materyallerinin sitouyumluluğunu farklı deneysel tasarımlara ve amaçlanan uygulamalara dayanarak değerlendirmek için üç farklı in vitro yöntem tanıtıldı. Materyaller ve çeşitli hücre tipleri arasındaki etkileşimler doğrudan kültür yöntemi, doğrudan maruz kalma kültürü yöntemi ve maruz kalma kültürü yöntemi ile araştırılabilir.
Bu video, biyolojik olarak parçalanabilen materyallerin bozunma ürünleri ile birlikte çeşitli tıbbi implant uygulamaları için hücre davranışları üzerindeki etkisini incelemek için anahtar in vitro yöntemler sunmuştur.
