Direkte und indirekte Kulturmethoden zur Untersuchung biologisch abbaubarer Implantatmaterialien in vitro. In den letzten Jahrzehnten wurden biologisch abbaubare Materialien für biomedizinische Anwendungen wie orthopädische, zahnärztliche und kraniale Kiefer- und Gesichtsimplantate umfassend erforscht. Um die biologisch abbaubaren Materialien für biomedizinische Anwendungen zu screenen, ist es notwendig, diese Materialien in Bezug auf In-vitro-Zellreaktionen, Zytokompatibilität und Zytotoxizität zu bewerten.
Standards in der Internationalen Organisation für Normung wurden bei der Bewertung von Biomaterialien weit verbreitet verwendet. Die meisten ISO-Normen wurden jedoch ursprünglich festgelegt, um die Stiltoxizität von nicht abbaubaren Materialien zu bewerten und somit einen begrenzten Wert für das Screening biologisch abbaubarer Materialien zu liefern. In diesem Video werden wir drei verschiedene Kulturmethoden vorstellen und diskutieren, nämlich die direkte Kulturmethode, die direkte Expositionskulturmethode und die Expositionskulturmethode zur Bewertung der In-vitro-Zytokompatibilität von biologisch abbaubaren Implantatmaterialien.
Konkret wertet die Direct-Culture-Methode die Wechselwirkungen zwischen neu ausgesäten Zellen und den Implantaten aus. Die direkte Expositionskultur ahmt die Wechselwirkungen zwischen den etablierten Zellen im Körper und den Implantaten nach. Die Expositionskultur charakterisiert die Wechselwirkungen zwischen etablierten Zellen und den Implantaten, wenn sie nicht in direktem Kontakt miteinander stehen, sondern in derselben Umgebung, in der sich die Materialien abbauen.
Dieses Video enthält Beispiele für die Verwendung dieser drei Kulturmethoden zur Untersuchung der In-vitro-Zytokompatibilität von biologisch abbaubaren Implantatmaterialien und deren Wechselwirkungen mit aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen. Die in diesem Video beschriebenen In-vitro-Methoden ahmen verschiedene Szenarien der In-vivo-Umgebung nach und erweitern die Anwendbarkeit und Relevanz der In-vitro-Zytokompatibilitätstests verschiedener Materialien für verschiedene biomedizinische Anwendungen. Wir befolgen ein Protokoll, das von der Institutional Animal Care and Use Community an der University of California in Riverside für die Zell- und Gewebegewinnung genehmigt wurde.
Zellkulturpräparation. Die drei in diesem Video beschriebenen Kulturmethoden sind allgemein für verschiedene Zelltypen anwendbar, die adhären. Hier werden BMSCs aus Rattenentwöhnungen als Beispiel für die Zellkulturpräparation Harvesting bone marrow-derived mesenchymal stem cells from rat weanlings vorgestellt.
Das schematische Diagramm in dieser Abbildung zeigt die Schritte zur Ernte von BMSCs aus Rattenentwöhnungen. Entfernen Sie die Haut und die Muskeln und das Bindegewebe, um den Femur aus der eingeschläferten Ratte zu sezieren. Legen Sie die Oberschenkelknochen in ein 15 ml konisches Röhrchen, das Zellkulturmedien enthält.
Legen Sie die konischen Röhren bis zum Zeitpunkt der Zellextraktion auf Eis. Geben Sie die Knochen in eine Petrischale in der biologischen Sicherheitswerkbank. Schneiden Sie die Enden des Knochens mit einer chirurgischen Klinge ab und spülen Sie das Knochenmark in einen 50 ml konischen Schlauch, indem Sie die Knochenmarkhöhle mit einer Spritze mit der 25 1/2 Gauge-Nadel mit Zellkulturmedien waschen.
Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70-Mikrometer-Filter, gefolgt von einer Zentrifugation bei 126-facher Schwerkraft für fünf Minuten, um die Zellpellets dazu zu bringen, überstehende Medien abzusaugen und mit 10 ml frischem Medium aufzufüllen. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen mit einer serologischen 10-ml-Pipette wieder zu suspendieren. Pippen Sie die Aufhängung direkt auf den Innenboden eines T-75-Kolbens und fügen Sie Medien hinzu, um das Volumen auf 25 Milliliter zu erhöhen.
Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator in einer sterilen Standard-Zellkulturumgebung von 37 Grad Celsius, befeuchteter Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid und 95% Luft. Nach drei bis sieben Tagen spülen Sie die nicht adhärenten Zellen ab, indem Sie die alten Medien anstreben und mit frischen Medien auffüllen. Setzen Sie die Kultivierung und Fütterung der Zellen mit frischen Medien fort, bis sie für die Zellpassage, das Einfrieren oder die Verwendung in einem Experiment bereit sind.
Probenvorbereitung und Sterilisation. Sterilisieren oder desinfizieren Sie alle Proben vor der Zellkultur. Sterilisations- oder Desinfektionsmethoden für verschiedene Probentypen variieren je nach den unterschiedlichen Eigenschaften der Materialien.
Verwenden Sie im Allgemeinen ultraviolette Strahlung, um biologisch abbaubare Metalle für In-vitro-Studien zu desinfizieren. Zellkulturmethoden. Das schematische Diagramm in dieser Abbildung zeigt die Schritte der direkten Kulturmethode.
In diesem Video wurden BMSCs auf einer aus Magnesium gewonnenen Platte kultiviert, die in den Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekultur-behandelten Platte als Beispiel platziert wurde, um die Kulturmethode zu veranschaulichen. Verwenden Sie einen 90%-Konfluationskolben, um die Zellkonzentration in der Zellsuspension mit einem Hämozytometer zu bestimmen. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit frischen Medien auf eine vorgeschriebene Zellkonzentration, die für die Zellstudie in vitro benötigt wird.
Platzieren Sie die Proben in der Mitte der 12-Well-Gewebekulturplatten. Spülen Sie die Kulturplatten nacheinander mit 2 ml PBS und 2 ml DMEM ab, um den osmotischen Druck unter sterilen Bedingungen zu kalibrieren. Fügen Sie 3 ml der verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung auf die interessierenden Proben hinzu.
Kultur der Zellen in einem Inkubator unter Standard-Zellkulturbedingungen für 24 Stunden. Das schematische Diagramm in Entstellung zeigt die Schritte der direkten Belichtungskultur. Bereiten Sie die Zellsuspension mit den erforderlichen Zellkonzentrationen vor, basierend auf dem experimentellen Design für verschiedene Zelltypen und beabsichtigte Anwendungen.
Spülen Sie die Kulturplatten nacheinander mit 2 ml PBS und 2 ml DMEM ab, um den osmotischen Druck unter sterilen Bedingungen zu kalibrieren. Fügen Sie 3 ml der verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung hinzu. Kultivieren Sie die Zellen im befeuchteten Inkubator unter Standard-Zellkulturbedingungen für 24 Stunden oder bis die Zellen 50% bis 80% Konfluenz erreichen.
Nach 24 Stunden spülen, die Zellen in der Vertiefung mit PBS mit einer Pipette plattieren, um schwimmende tote Zellen zu entfernen. Legen Sie die desinfizierten oder sterilisierten Proben direkt auf die anhaftenden Zellen. Fügen Sie 3 ml frisches Medium in jedes Vertiefungsfeld hinzu.
Kultivieren Sie die Zellen unter Standard-Zellkulturbedingungen für weitere 24 Stunden. Das schematische Diagramm in dieser Abbildung zeigt die Schritte der Belichtungskulturmethode. Die ersten Schritte für die Zellpräparation sind die gleichen wie bei der direkten Expositionskultur.
Anschließend legen Sie die Proben in die Vertiefungseinsätze mit einer Membranporengröße von 0,4 Mikrometern und legen die Vertiefungseinsätze mit den Proben in jede Vertiefung mit den Zellen. Kultivieren Sie die Zellen unter Standard-Zellkulturbedingungen für weitere 24 Stunden. Postkulturelle Charakterisierung von Zellen.
Für die direkte Kultur und die direkte Belichtungskultur fixieren, färben, abbilden und analysieren Sie die Zellen, die sowohl auf den Bohrlochplatten als auch auf den Proben haften. Für die Expositionskultur analysieren Sie die Zellen, die an den Bohrlochplatten haften. Sammeln Sie die Postkulturmedien aus jedem Vertiefungsraum in ein entsprechendes 15 ml konisches Rohr zur weiteren Analyse.
Sammeln Sie alle Proben nach der Kultur zur weiteren Analyse. Spülen Sie die Zellen, die sowohl an Proben als auch an den Bohrlochplatten haften, dreimal mit PBS aus. Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd in jede Bohrlochplatte hinzu.
Setzen Sie den Deckel wieder auf die Bohrlochplatte und lassen Sie die PFA 20 Minuten lang reagieren. Nach 20 Minuten die PFA absaugen und in eine Abfallflasche geben. Spülen Sie die Bohrlochplatte dreimal mit PBS ab, um die PFA zu entfernen, und geben Sie den Abfall in die Abfallflasche.
Bereiten Sie die Arbeitsmaterialien der Färbemittel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Fügen Sie 200 bis 400 Mikroliter verdünntes Alexa Fluor 488 Phalloidin-Färbemittel zu jeder Vertiefung hinzu, um die Zellen auf der Bohrlochplatte und die Probe abzudecken. Wickeln Sie die Bohrlochplatte in Aluminiumfolie, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und lassen Sie das Alexa Fluor 488 Phalloidin 20 Minuten bei Raumtemperatur reagieren.
Sammeln Sie das Alexa Fluor 488 Phalloidin Färbemittel und geben Sie es in die entsprechende Abfallflasche. Spülen Sie die Wandplatten dreimal mit PBS ab, um das überschüssige Alexa Fluor 488 Phalloidin zu entfernen und das gebrauchte PBS in die entsprechende Abfallflasche zu geben. Fügen Sie 200 bis 400 Mikroliter verdünntes DAPI zu jeder Vertiefung hinzu, um die Zellen in der Vertiefung und auf der Probe abzudecken.
Wickeln Sie die Vertiefungsplatte in Aluminiumfolie und lassen Sie den DAPI fünf Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren. Spülen Sie die Brunnenplatte dreimal mit PBS ab und geben Sie das gebrauchte PBS in die entsprechende Abfallflasche. Nach der Färbung stellen Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.
Nehmen Sie, wann immer möglich, zusätzlich zu Fluoreszenzbildern Phasenkontrastbilder von Zellen auf. Stellen Sie die Zellen auf den biologisch abbaubaren Proben so schnell wie möglich oder unmittelbar nach der Färbung ab, um mögliche Veränderungen, die durch den kontinuierlichen Abbau von Proben verursacht werden, zu vermeiden oder zu reduzieren. Für die direkte Kultur und die direkte Belichtungskultur können Sie zwei Arten von Zellen abbilden und bewerten.
Erstens, die Zellen auf den Proben in direktem Kontakt mit den Proben, und zweitens, die Zellen haften auf der Vertiefungsplatte, die die Proben in direktem Kontakt mit den Proben umgibt, wie in der Abbildung gezeigt. Verwenden Sie für die Belichtungskultur, wie hier gezeigt, die Bildführung, wenn Sie die Fluoreszenzbilder von Zellen aufnehmen, um festzustellen, ob die Reaktion der Zelle als Reaktion auf den dynamischen Abbaugradienten der Proben unterschiedlich wäre. Abbildung und Analyse von Zellen, die sich im Bereich innerhalb des inneren Rings, 3,5 mm vom Zentrum entfernt, und des äußeren Rings, der 7 mm vom Zentrum entfernt ist, befinden.
Nehmen Sie für jede Probe und in den Kulturplatten nach dem Zufallsprinzip mindestens fünf Bilder aus jedem Bereich von Interesse auf, in dem die Zellen entweder indirekter Kontakt oder indirekter Kontakt mit den Proben in einer vordefinierten Entfernung sind. Aus allen Zellbildern, die aus Schritt 4.3 gewonnen wurden, quantifizieren Sie die Zellmorphologie, indem Sie die Zellausbreitungsfläche und das Seitenverhältnis für die Bildanalyse messen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in jedem Bildbereich.
Berechnen Sie die Zelladhäsionsdichte unter direkten und indirekten Kontaktbedingungen als Anzahl der Zellen pro Flächeneinheit. Postkulturelle Analysen von Medien und Proben. Sammeln Sie vor der Selbstfixierung die postkulturellen Medien.
Messen Sie die pH-Werte der Postkulturmedien in jedem Vertiefungsraum unmittelbar nach der Entnahme mit einem vorkalibrierten pH-Messgerät. Nach dem vorherigen Schritt der pH-Messung sammeln und verdünnen Sie die Medien mit einem wünschenswerten Verdünnungsfaktor für eine optimale Messung der Ionenkonzentrationen. Messen Sie die Konzentrationen der interessierenden Ionen in den Postkulturmedien mit einem induktiv gekoppelten plasmaoptischen Emissionsspektrometer, abgekürzt ICP-OES.
Nach einer In-vitro-Zellstudie können sich die biologisch abbaubaren Proben in Dimension, Masse, Oberflächenmorphologie, Mikrostruktur und Zusammensetzung ändern. Die Postkulturanalyse von Proben hilft, den Abbaumechanismus von Proben zu verstehen. Machen Sie nach der Zellkultur die Fotos der Proben, um mögliche Veränderungen der Probendimension, Farbe, Morphologie und anderer sichtbarer Merkmale zu zeigen.
Trocknen oder dehydrieren Sie die Postkulturproben und messen Sie die Probenmasse, -dimension und -volumen, um Änderungen der Masse, der Dimension und des Volumens zu quantifizieren. Verwenden Sie ein Rasterelektronenmikroskop, um die Mikrostruktur und Morphologie der Proben zu charakterisieren. Verwenden Sie energiedispersive Röntgenspektroskopie und Röntgendefraktion, um die Zusammensetzung und Phase der Abbauprodukte auf den Proben zu charakterisieren.
Verwenden Sie FTIR oder ATR, um die chemische Bindung auf Probenoberflächen nachzuweisen. Repräsentative Ergebnisse. Hier zeigt die Abbildung die repräsentativen Fluoreszenzbilder von aus dem Knochenmark gewonnenen Stammzellen unter direkten und indirekten Kontaktbedingungen unter verschiedenen Kulturmethoden.
Diese Abbildung zeigt die Beispieldaten für die quantifizierte Zelladhäsionsdichte. Wie in Abbildung A gezeigt, weisen BMSCs in direkter Kontaktaufnahme mit dem ZC21 in der 24-Stunden-Direktexpositionskultur eine signifikant höhere Zelladhäsionsdichte auf als jede andere Gruppe. Wie in Abbildung B gezeigt, ist die BMSC-Adhäsionsdichte im indirekten Kontaktzustand der direkten Expositionskultur für die ZC21-Gruppe signifikant höher als für die Magnesiumgruppe.
Es zeigt jedoch keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zum T64 und Zellen nur Kontrollgruppen. Hier zeigt Abbildung A den pH-Wert von postkulturellen Medien nach der direkten Belichtungskultur und der direkten Kultur. Für die Direktbelichtungskultur liegen die pH-Werte der Medien für alle Proben zwischen 8,3 und 8,4.
In der direkten Kultur liegen die pH-Werte der Medien gruppenübergreifend zwischen 7,9 und 8. Abbildung B zeigt die Magnesiumionenkonzentration in den Postkulturmedien. Sowohl in der direkten Expositionskultur als auch in der direkten Kultur sind ihre Magnesiumionenkonzentrationen in der ZC21- und Magnesiumgruppe signifikant höher als in allen anderen Kontrollgruppen.
Diese Abbildung zeigt die XRD-Muster für ZSr41 und reines Magnesium nach einer dreitägigen Expositionskultur. Die kristallinen Phasen verschiedener Zusammensetzungen wie Magnesium, Zinkoxid und Hydroxylapatit wurden beobachtet. Hier zeigt Abbildung A die Überlagerung von REM-Bildern und EDX-Karten der Oberflächenelementzusammensetzung für magnesiumoxidbeschichtetes Magnesium und die Kontrolle von Magnesiumsubstraten und Glas nach 24 Stunden direkter Kultur mit BMSCs.
Abbildung B zeigt die quantitative Oberflächenelementzusammensetzung der Probenoberflächen und zeigt verschiedene Ablagerungen, die während der Zellkultur gebildet wurden. Schlüsse. In diesem Video haben wir drei verschiedene In-vitro-Methoden zur Bewertung der Zytokompatibilität von biologisch abbaubaren Implantatmaterialien anhand unterschiedlicher experimenteller Designs und beabsichtigter Anwendungen vorgestellt. Die Wechselwirkungen zwischen Materialien und verschiedenen Arten von Zellen konnten durch die direkte Kulturmethode, die direkte Expositionskulturmethode und die Expositionskulturmethode untersucht werden.
Dieses Video hat wichtige In-vitro-Methoden vorgestellt, um die Wirkung von biologisch abbaubaren Materialien zusammen mit ihren Abbauprodukten auf das Zellverhalten für eine Vielzahl von medizinischen Implantatanwendungen zu untersuchen.
