Le protocole de gélification produit des réactions qPCR prêtes à l’emploi qui diminuent le temps et les étapes nécessaires pour commencer une course. Ce protocole permet de produire et de contrôler la qualité et les grandes quantités des réactions qPCR à la fois, ce qui réduit les risques d’erreur de l’opérateur lors des calculs de recette ou de l’aliquote dans les puits. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle qPCR déjà entièrement optimisée dans le format congelé conventionnel.
La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que deux des principales étapes du contrôle de la qualité sont visuelles. Pour préparer la solution de mélezitose, pesez quatre grammes de mélezitose dans un tube en plastique de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et tourbillonnez à la vitesse maximale jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Faire le volume final à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase, puis étiqueter et stocker la solution à deux à huit degrés Celsius jusqu’à six mois.
Pour préparer la solution de tréhalose, pesez quatre grammes de tréhalose dans un tube en plastique de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et vortex à la vitesse maximale jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Ensuite, porter le volume à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 micron. Étiquetez et conservez la solution à une température de deux à huit degrés Celsius pendant une période allant jusqu’à six mois.
Pour préparer la solution de glycogène, pesez deux grammes de glycogène dans un tube de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et vortex jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Gardez la solution à deux à huit degrés Celsius pendant huit à 12 heures parce que la solubilisation du glycogène produit beaucoup de bulles. Le lendemain, en retirant la solution de l’incubation, porter le volume à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase et stocker la solution étiquetée à une température de deux à huit degrés Celsius pendant six mois.
Pour préparer la solution de lysine, pesez 7,5 milligrammes de lysine dans un tube de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et vortex jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Compléter le volume à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micron et conservez-la entre deux et huit degrés Celsius pendant six mois.
Pour préparer le mélange de gélification, mélangez les volumes appropriés de solutions mères dans un tube en plastique de 50 millilitres. Mélanger les réactifs en retournant le tube 10 fois et conserver la solution étiquetée à deux à huit degrés Celsius pendant trois mois. Pour préparer le mélange maître qPCR pour la gélification, décongelez les réactifs dans un récipient réfrigéré.
Ensuite, mélanger les volumes appropriés de réactifs dans un tube de 1,5 millilitre pour préparer suffisamment de mélange maître pour une bande de huit tubes ou une plaque de 96 puits. Ensuite, pipeter 18,5 microlitres du mélange maître de gélification sur chaque puits de réaction et placer les tubes ou la plaque dans le support conducteur de chaleur à l’intérieur du four à vide. Si vous utilisez des plaques de 96 puits, placez un sac d’argile bentonite dans le four pour deux plaques de 96 puits pour l’absorption d’eau.
Lorsque le cycle est terminé, vérifiez les tubes ou les plaques pour une bonne gélification des réactifs en vous assurant que le volume est visiblement réduit à environ cinq microlitres et que les liquides ne bougent pas en tapotant les tubes ou les plaques avec les doigts. Scellez et entreposez les tubes ou les plaques à une température de deux à huit degrés Celsius pendant huit à 12 heures avant utilisation. Pour utiliser la qPCR gélifiée, retirez la bande ou la plaque du tube du réfrigérateur et ouvrez-la dans un poste de travail pour la manipulation des échantillons.
Ajouter 15 microlitres d’eau exempte de nucléases et cinq microlitres d’échantillon d’ADN à chaque récipient de réaction. Scellez les tubes ou les plaques, exécutez l’expérience souhaitée et effectuez une analyse régulière des données. Dans le protocole actuel, la température à l’intérieur de la chambre est maintenue constante à 30 degrés Celsius, tandis que la pression varie entre 910 et 930 millibars et proche du vide.
Après le cycle de vide, le mélange principal à l’intérieur du tube diminue en volume, devient gélifié au fond et n’éclabousse pas les parois lorsque les tubes sont taraudés. Si la gélification est incomplète, le liquide éclabousse sur les parois du tube lorsque les tubes sont tapotés. La détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi à l’aide de séquences d’oligonucléotides publiées est présentée ici.
La détection du même échantillon lorsque la gélification n’a pas été correctement exécutée a entraîné une perte de sensibilité. L’étape la plus critique est le calcul du volume des réactifs avant la gélification. L’opérateur doit se rappeler de ne pas ajouter d’eau, car elle sera éliminée pendant le processus.
Si les étapes du protocole sont suivies de près, les opérateurs ayant des compétences de base en laboratoire et en biologie moléculaire n’auront aucune difficulté à effectuer le processus de gélification.
