Nous avons développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur XF hippocampe pour mesurer directement le taux de consommation d’oxygène. Mais proxy commun pour la fonction mitochondriale dans la tranche de lame aiguë de souris adultes. Cette méthode mesure un cellulaire par l’énergie dans les ponctions à partir de structures cérébrales anatomiquement définies.
L’utilisation de tranches aiguës imite plus étroitement l’environnement cellulaire physiologique, ce qui ne peut pas être réalisé de la même manière que les cellules mitochondriales ou de culture isolées. Cette méthode intéressera grandement les chercheurs travaillant dans le domaine de la maladie de Parkinson et de la maladie de Huntington. Pour commencer, ouvrez le kit de dosage de flux extracellulaire et retirez à la fois la cartouche du capteur et la plaque utilitaire.
Placez ensuite la cartouche du capteur de côté et ne touchez pas les capteurs. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de solution d’étalonnage à chaque paroi de la plaque utilitaire. Placez la cartouche de capteur sur le dessus de la plaque d’utilité et immergez les capteurs dans la solution d’étalonnage, en vous assurant que l’encoche triangulaire de l’utilitaire et la plaque de cartouche de capteur sont correctement alignées.
Ensuite, scellez le kit de dosage de flux extracellulaire avec un film d’étanchéité pour empêcher l’évaporation de la solution d’étalonnage, puis placez-le dans un incubateur de 37 degrés Celsius non complété par du dioxyde de carbone ou de l’oxygène, pendant la nuit. Ouvrez la micro plaque de capture des œillets et retirez la plaque d’œillets pour la position assise des tissus. Ensuite, réchauffez un volume approprié de tampon de liquide céphalorachidien artificiel modifié pré-oxygéné à 37 degrés Celsius dans un tube de 50 millilitres.
Ensuite, ajoutez BSA à une concentration finale de quatre milligrammes par millilitre pour préparer le tampon respiratoire. Ajoutez soigneusement 625 microlitres de tampon respiratoire à chaque puits de la plaque oculaire tout en évitant de secouer la plaque, en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le tampon de chaque puits. Disséquez immédiatement le cerveau dans 10 millilitres de solution de coupe pré-oxygénée glacée.
Ensuite, en utilisant une section vibratome de tranches striatales coronales, en suivant les instructions du fabricant à une épaisseur de 150 micromètres dans une solution de coupe pré-oxygénée glacée. Ensuite, récupérez les tranches dans 50 millilitres de liquide céphalorachidien artificiel oxygéné. Et conservez-les en solution jusqu’à 30 minutes à température ambiante.
Après récupération, transférer les tranches dans une boîte de Petri de 35 par 10 millimètres avec cinq millimètres de tampon respiratoire. À l’aide d’un poinçon de biopsie en acier inoxydable, créez un morceau de tissu circulaire dans la zone souhaitée du cerveau tranché en appuyant doucement sur le poinçon tout en gardant la tranche dans le tampon. Ensuite, retirez le reste du tissu, soulevez le poinçon et retirez le morceau de tissu circulaire dans le tampon.
Ensuite, coupez l’extrémité même d’une pointe de pipette d’un millilitre pour faire un trou d’un diamètre d’un point cinq à deux points zéro millimètre et utilisez-le pour maintenir et transférer la tranche perforée vers le haut de l’écran de capture. Aspirez un morceau de tissu cérébral perforé et placez soigneusement le tissu sur le côté maillé de l’écran de capture, un morceau de plastique circulaire avec le maillage attaché d’un côté. À l’aide d’un mouchoir en papier, séchez doucement l’écran de capture et éliminez l’humidité, ce qui permet au tissu de devenir collant et attaché au centre du maillage.
Ensuite, maintenez l’écran de capture côté tranche vers le bas avec une pince à épiler et placez-le dans l’un des puits de la plaque d’œillets en incubation. Ensuite, incubez la plaque d’œillets à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant au moins 30 minutes pour permettre l’équilibrage de la température et du pH avant d’exécuter le test. Diluer les composés souhaités et le liquide céphalorachidien artificiel modifié sans BSA jusqu’à la concentration finale en stock de la concentration de travail pour les ports A à D, respectivement.
Préchargez doucement 75 microlitres des composés dilués dans les orifices d’injection appropriés de la cartouche de capteur en plaçant les pointes à mi-chemin dans les orifices d’injection à un angle de 45 degrés avec la pointe contre la paroi de l’orifice d’injection, car une insertion complète peut provoquer une fuite de composé à travers le port. Ensuite, retirez soigneusement les embouts des orifices sans créer de bulles d’air et ne touchez aucune partie de la cartouche pour éviter d’atténuer les bulles d’air. Ensuite, inspectez visuellement les orifices d’injection pour un chargement uniforme en vous assurant que tout le liquide est dans le port et qu’aucune goutte résiduelle n’est présente sur le dessus de la cartouche.
Après avoir placé la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire, placez-la dans un incubateur pendant 30 minutes pour lui permettre de chauffer jusqu’à 37 degrés Celsius tout en la manipulant avec précaution en ne tenant que la plaque utilitaire et en la déplaçant le moins possible. Chargez d’abord le modèle de test dans le logiciel, puis appuyez sur le bouton de démarrage vert. Chargez ensuite la cartouche de capteur sur la plaque utilitaire dans le plateau d’instruments, en vous assurant que la plaque est correctement assise et à plat, en chargeant la cartouche de capteur remplie de médicament dans l’analyseur pour étalonnage.
Ensuite, suivez les instructions à l’écran afin de calibrer. Et équilibrez les capteurs. Une fois l’étape d’équilibrage terminée, retirez la plaque d’étalonnage et remplacez-la par la plaque d’œillet contenant le maillage et les tranches de tissu.
Ensuite, mesurez le taux de consommation d’oxygène dans chaque puits de la plaque, en utilisant les protocoles de dosage décrits dans le manuscrit. Ensuite, analysez les données de mesure du taux de consommation d’oxygène et les données d’efficacité du couplage. Les taux de consommation d’oxygène pour différentes épaisseurs et tailles de poinçonnage des tranches du groupe témoin ont montré une respiration basale stable sur l’ensemble de la mesure et étaient proportionnels au volume de la tranche.
De plus, les taux de consommation d’oxygène ont été relativement stables pendant cinq heures avec moins de 10 % de réduction. L’efficacité du couplage mitochondrial a été comparée et la tranche à l’épaisseur de 150 micromètres et à une taille de poinçon de 1,5 millimètre a montré l’efficacité de couplage la plus élevée. Les taux de consommation d’oxygène ont été mesurés pour les groupes jeunes et âgés de Pink1 knockout et leurs souris de type sauvage appariées selon l’âge.
Le taux de consommation basale d’oxygène était similaire dans les groupes knockout et wild-type pour les jeunes souris. Cependant, il a diminué pour les souris knock-out dans l’ancien groupe. Cependant, le dysfonctionnement mitochondrial chez les souris knockout a été observé pour le groupe d’âge jeune, indiqué par la diminution de l’efficacité du couplage causée par le knockout de Pink1.
Les étapes critiques de ce protocole comprennent la préparation des tranches de cerveau, leur transfert en haut de l’écran de capture, le placement des diapositives dans les puits et leur maintien attachés à l’écran de capture pendant les mesures.
