Ce protocole met en évidence les étapes clés pour amplifier, différencier et cryoconserver les cellules épithéliales nasales primaires. Dans nos conditions de culture, les cellules épithéliales nasales primaires imitent l’épithélium pulmonaire. Cela permet des cultures dérivées de patients et des études de médecine personnalisée à partir de cellules fraîches ou biobanquées.
Les cultures épithéliales nasales dérivées du patient peuvent être utilisées pour évaluer l’activité cftr et aider au traitement de la fibrose kystique en évaluant la réponse individuelle du patient aux nouveaux traitements. La démonstration de la procédure sera assurée par Aurélie Hatton, une ingénieure de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez des cellules épithéliales nasales ou HNE, dans 10 millilitres de milieu d’amplification.
Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans une fiole enrobée de collagène de 75 centimètres carrés jusqu’à ce qu’elle atteigne 80 à 90% de confluence. Changez le support toutes les 48 à 72 heures. Plus tard, lavez les cellules avec 10 millilitres de magnésium et de DPBS sans calcium.
Aspirer et jeter la solution saline. Avant d’ajouter deux millilitres de 0,25% de trypsine et de remettre la fiole à l’incubateur pendant huit à 12 minutes. Plus tard, tapotez fermement la fiole avec une paume pour aider au détachement cellulaire.
Ajouter 10 millilitres du milieu d’amplification pour arrêter la réaction enzymatique. Rincer vigoureusement la fiole à l’aide d’une pipette de 10 millilitres pour aspirer et expulser le milieu d’amplification sur la surface de la fiole pour rincer et détacher les cellules et recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.
Remettez la pastille dans cinq à 10 millilitres de milieu d’amplification. Ensuite, comptez les cellules sur un hémocytomètre. Après le comptage des cellules, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.
Ensuite, remettez la pastille dans le milieu de congélation enrichi pour obtenir trois à cinq fois 10 à six cellules par millilitre et placez-la dans un flacon cryogénique. Congelez lentement les cellules en réduisant la température d’environ un degré Celsius par minute dans un récipient de cryocongélation approprié à moins 80 degrés Celsius. Le lendemain, déplacez l’échantillon conservé dans un récipient de stockage d’azote pour un stockage à long terme.
Réchauffez le milieu d’amplification fraîchement préparé dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius. Retirez les flacons cryogéniques du réservoir de stockage d’azote et placez-les rapidement dans le bain-marie, en prenant soin de ne pas immerger tout le flacon dans l’eau. Retirez les flacons cryogéniques du bain-marie lorsqu’il ne reste qu’une petite gouttelette congelée.
Essuyez les flacons avec 70% d’alcool et placez-les sous le capot. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez les cellules décongelées dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu d’amplification chaud de manière goutte à goutte.
Après une minute, ajoutez un autre millilitre de milieu d’amplification et attendez une minute. Ajouter 10 millilitres de milieu d’amplification et centrifuger à 500 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer et jeter le surnageant.
Remettez la pastille dans un volume de milieu d’amplification nécessaire pour atteindre une densité cellulaire d’une fois 10 à six cellules par millilitre. Après avoir ensemencé les cellules sur une fiole enrobée de collagène de 25 centimètres carrés, contenant un milieu d’amplification, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Observez visuellement l’expansion cellulaire pendant deux à trois jours avant d’effectuer l’amplification cellulaire comme démontré précédemment.
Ensemencez les cellules à une densité de 3,3 fois 10 à la cinquième cellule par filtre sur des filtres poreux enrobés de collagène de 0,33 centimètre carré, complétés par 300 microlitres de milieu d’amplification du côté apical et 900 microlitres de milieu liquide d’air du côté basolatéral. Après trois jours, aspirer le milieu apical et cultiver les cellules à l’interface air-liquide pendant trois à quatre semaines dans le milieu air-liquide pour établir un épithélium différencié. Changez le milieu basal toutes les 48 à 72 heures.
Les cellules HNE fraîches cultivées à l’interface air-liquide présentaient des caractéristiques typiques de l’épithélium respiratoire polarisé et différencié. Dans les 78 échantillons de cellules HNE, les taux de réussite ont été comparés dans le brossage nasal ensemencé immédiatement et après un à sept jours de transport dans un milieu de rinçage. Le pourcentage moyen initial de cultures réussies était de 82% et a atteint 87% dans les échantillons ensemencés entre zéro et cinq jours.
83% des échantillons qui se sont différenciés avec succès dans des conditions fraîches ont également été retenus dans des échantillons cryoconservés. De même, dans les échantillons qui n’ont pas réussi à se différencier dans des conditions fraîches, 71 % n’ont pas réussi dans des conditions de gel-dégel. De plus, 50% des échantillons congelés entre deux et trois fois 10 à six cellules par flacon cryogénique n’ont pas réussi à se développer lors de la décongélation, atteignant 80% pour moins de deux fois 10 aux six cellules.
Pour le changement de courant de court-circuit en réponse à la forskoline et le changement de courant de court-circuit en réponse à l’inhibiteur CFTR 172 dans les cellules HNE traitées par DMSO, aucune différence significative n’a été observée entre l’HNE décongelée fraîche ou congelée. Après le traitement, les deux types de cellules ont montré une correction significative avec une augmentation du changement de courant de court-circuit en réponse à la forskoline et une diminution du changement de courant de court-circuit en réponse à l’inhibiteur CFTR 172. la réponse corrective des bithérapies de la fonction CFTR a été évaluée par rapport aux cellules HNE traitées par DMSO court-circuiter le changement de courant en réponse à la forskoline et en réponse à l’inhibiteur CFTR 172 ont été significativement améliorées par VX-809 plus VX-770 et VX-661 plus VX-770.
Trois traitements modulateurs CFTR différents chez l’HNE de six patients homozygotes F508del ont été comparés. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec un correcteur et un potentialisateur CFTR, les modulateurs de vertex et de CFTR corrigent le changement de courant de court-circuit en réponse à la forskoline et le changement de courant de court-circuit en réponse à l’inhibiteur CFTR 172 dans une mesure similaire. Lors de la congélation des cellules HNE, il est important d’avoir au moins 3 millions de cellules par flacon cryogénique pour augmenter les chances d’un bon résultat lors de la décongélation.
L’activité CFTR dans les cellules HNE s’est avérée être un bon modèle prédictif pour évaluer et ajuster les thérapies personnalisées dans la fibrose kystique.
