Un traitement individualisé pour les patients atteints de mucoviscidose peut être réalisé par un modèle de maladie in vitro pour comprendre l’activité CFTR au départ. Les organoïdes épithéliaux nasaux humains, ou organoïdes HNE, produisent des lumens de différentes tailles qui sont en corrélation avec l’activité CFTR, distinguant les organoïdes CF et non CF. Ici, nous avons décrit en détail une méthodologie pour la culture et l’imagerie de ces organoïdes HNE.
Le transport dysfonctionnel des ions épithéliaux, en particulier celui du chlorure et du bicarbonate, entraîne une diminution du volume des fluides de la muqueuse épithéliale. Cela affecte également les sécrétions de mucus conduisant à la mucostase et à l’obstruction. Par conséquent, notre modèle HNE a été développé pour diverses applications, en fonction de la conception expérimentale et des ressources de l’investigateur.
Outre l’évaluation de l’activité cftr au départ ou en réponse à des traitements, cette technique peut également être appliquée à d’autres maladies impliquant la fonction des cellules épithéliales, en particulier le transport du liquide cellulaire épithélial. Ces méthodes ont été développées principalement pour être utilisées dans les études sur la fibrose kystique. D’autres études évaluant l’épithélium des voies respiratoires, telles que la dyskinésie ciliaire primaire, peuvent également trouver ces méthodes utiles.
Ces techniques nécessitent une attention aux détails et à la précision. Ils nécessitent également une observation attentive pour s’assurer que l’expansion initiale des cellules est appropriée. Surveillez toutes les cultures tous les jours, et le succès sera plus probable.
Pour commencer, dissocier la biopsie de la brosse nasale en 8 millitres de milieu RPMI dans un tube conique de 15 millilitres en passant la brosse de cytologie plusieurs fois à travers une pointe de pipette de gros calibre d’un millilitre. Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant, puis remettez-la en suspension dans trois millilitres de solution de détachement cellulaire.
Incuber à température ambiante pendant 16 minutes pour digérer. Utilisez cinq millilitres de milieu d’expansion pour laver les cellules deux fois. Ensuite, ajoutez-les à une fiole T75, pré-ensemencée avec des fibroblastes 3T3 irradiés, inactivés et confluents à 50 à 60%.
Permettre aux cellules de co-cultiver et de se développer dans le milieu d’expansion pendant 7 à 14 jours. Si des antibiotiques ont été introduits pour des cellules dérivées de patients atteints de mucoviscidose, les milieux doivent être remplacés par des milieux d’expansion sans antibiotiques après les trois premiers jours de culture et peuvent continuer à changer de milieu tous les deux jours jusqu’à 80% de confluent. Lavez les cellules avec 1x DPBS.
Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de 0,05% de trypsine-EDTA dans la fiole T75 et incubez pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius pour éliminer le fibroblaste 3T3 irradié et inactivé de la culture. Rincez la fiole T75 avec 1x DPBS deux fois pour bien laver les fibroblastes 3T3 restants. Ajouter 1,5 millilitre de 0,05 % de trypsine-EDTA dans la fiole T75 et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius pour détacher les HNE.
Neutraliser la trypsine avec un inhibiteur de la trypsine de soja à un rapport de un pour un. Centrifugez les cellules à 500 fois gi pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le surnageant et lavez les cellules avec cinq millilitres de milieu d’expansion une fois.
Les cellules sont maintenant prêtes à être ensemencées pour développer des organoïdes. Décongelez la matrice extracellulaire ou ECM de culture organoïde pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Refroidir les diapositives d’angiogenèse à 15 puits pendant la nuit à la même température.
Ensuite, refroidissez les pointes de la pipette à quatre degrés Celsius. Enduisez les toboggans de cinq microlitres de froid 100% ECM sur de la glace. Placez-les dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour la consolidation.
Compter les HNE récoltés en co-culture à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, diluez les cellules à 500 cellules par microlitre en nombre total, avec 20% ECM dilué par des milieux de différenciation sur glace. Sortez les lames revêtues d’ECM de l’incubateur et ensemencez cinq microlitres du mélange ECM à cellules froides dans chacun des puits.
Transférer les lames immédiatement dans un incubateur de culture à 37 degrés Celsius pendant une heure pour consolider le mélange ECM cellulaire. Après cela, sortez les lames de l’incubateur et alimentez les cellules dans chaque puits des lames d’angiogenèse à 15 puits avec 50 microlitres du milieu de différenciation. Retournez la lame dans l’incubateur de culture à 37 degrés Celsius, en changeant le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les organoïdes soient prêts pour d’autres expériences.
Prétraitez les glissières de la chambre à fond de verre à 8 puits avec de l’adhésif cellulaire pendant 30 minutes. Jeter la solution et sécher les puits à l’air libre pendant encore 30 minutes. Ensuite, jetez le média du haut de l’ECM, puis ajoutez 50 microlitres du PBS froid 1x dans chaque puits des 15 puits sur glace.
Pipette de haut en bas trois à cinq fois en utilisant 200 microlitres de la pointe de la pipette de gros calibre. Distribuer la solution au centre d’un puits des glissières de chambre à 8 puits. Retirez immédiatement l’excès de liquide des puits à l’aide d’une pipette à pointe fine.
Ensuite, placez la chambre glisser dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 40 minutes pour améliorer l’organoïde adhérant au fond du verre. Après 40 minutes, lavez doucement les organoïdes avec 1x PBS deux fois et fixez-les avec 300 microlitres de 4% de paraformaldéhyde dans chaque puits pendant 30 minutes à température ambiante réglée. Lavez deux fois avec 1x PBS et stockez les organoïdes dans 1x PBS réglé à quatre degrés Celsius pour l’immunocoloration jusqu’à deux semaines.
Pour prélever les organoïdes pour des études histologiques, retirez le milieu de la culture et ajoutez 50 microlitres de froid un 1x PBS dans chaque puits des lames sur glace. Pipette de haut en bas trois à cinq fois à l’aide d’une pointe de pipette de gros calibre de 200 microlitres. Combinez toutes les solutions de la lame de 15 puits ou des inserts de culture dans un tube conique de 15 millilitres sur glace.
Réglez le volume total de la solution dans le tube à 10 millilitres en ajoutant 1x PBS froid. Centrifuger le tube à quatre degrés Celsius, 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et ajoutez 60 microlitres d’histogel chaud à mélanger avec la pastille organoïde à l’aide d’une pointe de pipette de gros calibre de 200 microlitres.
Transférer immédiatement la suspension dans un moule d’histologie. Après avoir consolidé l’histogel à température ambiante, mettez le bloc de moisissure dans du paraformaldéhyde à 4% pour la fixation pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ouvrez le logiciel et faites un clic droit en bas de l’écran.
Ensuite, sélectionnez Contrôles d’analyse, puis Résultats de mesure automatisés. Ouvrez l’image organoïde et sélectionnez 5 à 10 organoïdes avec des lumens visibles. Maintenez la touche droit de la souris sur l’image pour ouvrir le menu et sélectionnez Roi polygonal pour dessiner le contour de l’organoïde complet afin d’obtenir la surface totale de l’organoïde.
Ensuite, tracez le contour de la lumière pour obtenir la zone de la lumière. Répétez cette opération pour les organoïdes restants dans le puits et tous les puits du test. Enfin, exportez les données vers Excel.
Divisez la zone lumineuse par la surface totale et faites la moyenne de tous les organoïdes de l’échantillon pour obtenir le rapport de lumen de base. Les images en champ lumineux représentent les HNE d’une collecte d’échantillons réussie et infructueuse. Les HNE poussent bien dans un grand cluster.
En revanche, les HNE se développent mal en deux petits amas entourant les cellules 3T3 irradiées. Les organoïdes de la diapositive à 15 puits ont des images plus précises et plus nettes que celles de l’insert de culture. En outre, aucune différence morphologique significative n’a été observée dans ces deux méthodes de culture.
Les organoïdes non atteints de mucoviscidose ont généralement une lumière plus grande et plus fluide que les organoïdes de la mucoviscidose. La coloration HNE dans les organoïdes d’un sujet non CF, F508del/F508del, et la coloration immunofluorescente des cils dans un organoïde sont montrées dans ces images. Les cils colorés avec de la tubuline acétylée, l’anticorps secondaire marqué FITC et les noyaux marqués avec DAPI sont montrés ici.
Les images de projection maximale des deux organoïdes représentatifs par coloration immunofluorescente de montage entier et leurs images de reconstruction tridimensionnelle correspondantes sont montrées ici. Le mucus et les cils dans la lumière des organoïdes sont montrés. Les images graphiques représentent le test de gonflement induit par la forskoline pour tester la fonction CFTR sur les cellules épithéliales nasales primaires.
Une expérience dose-réponse représentative de la forskoline chez des volontaires non atteints de mucoviscidose est présentée ici. La dose-réponse de FSK est comparée à un changement fractionnaire moyen à une heure, par rapport à huit heures, ce qui suggère que le test de huit heures peut produire une différence de gonflement plus significative entre les différentes doses de FSK que celles d’une heure. L’aire sous la courbe peut montrer une différence mineure de gonflement par rapport au changement fractionnaire moyen à huit heures.
En essayant cette procédure, gardez à l’esprit que les organoïdes seront perdus pendant le processus de collecte, de fixation et de coloration. Ainsi, un soin méticuleux doit être apporté à chaque étape et un nombre de départ suffisant doit être obtenu pour assurer le succès. La croissance d’organoïdes dans des inserts de culture peut aider à cet égard, car ces techniques sont développées.
Ici, nous avons utilisé des réactifs et des fournitures disponibles dans le commerce pour faciliter l’expansion à d’autres chercheurs. Un test fonctionnel a également été développé qui utilisait des techniques de microscope courantes et un équipement plus spécialisé.
