Ce protocole combine une méthodologie cliniquement pertinente avec un modèle de recherche animal bien établi. Il aidera à répondre aux questions sur le développement auditif et le raffinement et les changements fonctionnels de l’audition après une manipulation génétique. Cette technique est non invasive, elle ne nécessite donc aucune intervention chirurgicale et pourrait être combinée avec des expériences supplémentaires.
En outre, il ne faut qu’environ une heure pour performer. Cette méthode pourrait être utilisée sur n’importe quelle espèce de petit oiseau. La physiologie comparative est donc relativement facile.
L’ABR de poulet peut également évaluer l’effet sur l’audition fonctionnelle après une manipulation génétique. Commencez par acquérir des œufs de poule de livourne blanc fécondés. Ensuite, incubez l’œuf à 38 degrés Celsius et une humidité de 50% pendant 21 jours avant la date de test souhaitée.
Une fois l’œuf éclos, pesez l’animal en le plaçant doucement dans un grand bateau de pesée. Après l’injection d’anesthésie, replacez l’animal dans l’incubateur. Ensuite, vérifiez si le cou est mou et pincez l’orteil de l’animal à l’aide d’une pince.
Comme étape suivante, déterminez le sexe du poulet à l’aide de ses plumes d’ailes. Plus tard, appliquez une crème dépilatoire avec un applicateur de pointe en coton sur la tête et le cou, en particulier près de l’ouverture de l’oreille pour l’oiseau. Maintenant, utilisez des lingettes à 70% d’alcool isopropylique pour essuyer les plumes, toute crème dépilatoire restante et la peau de la tête et du cou.
Stérilisez également les électrodes sous-cutanées et la sonde rectale à l’aide d’une lingette à 70% d’alcool isopropylique. Placez l’animal dans une chambre insonorisée et blindée électriquement, en veillant à ce que l’environnement ait un bruit électrique et acoustique minimal pour les meilleurs enregistrements. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de l’animal.
Maintenant, insérez la sonde rectale et fixez la tête de l’animal en place ou posez le bec contre un objet pour éviter tout mouvement indésirable. Ensuite, assurez-vous que la chambre de contrôle de la température maintient la température de l’animal entre 37 et 41 degrés Celsius. Utilisez trois électrodes à aiguille en acier inoxydable, en chlorure d’argent comme électrodes de référence, actives et de masse commune.
Placez chaque électrode sous-cutanée de deux à trois millimètres dans la tête, mais pas assez profondément pour pénétrer dans le crâne, puis sortez l’électrode de la peau, exposant la pointe. Pour l’enregistrement à canal unique, placez l’électrode active au-dessus du crâne à la ligne médiane aussi loin caudale que le conduit auditif. Placez l’électrode de référence derrière l’oreille où le stimulus sera délivré et placez l’électrode de terre derrière l’oreille controlatérale dans le cou.
Maintenant, vérifiez l’impédance de l’électrode. Assurez-vous que l’impédance globale de l’électrode ne dépasse pas cinq kilos ohms. De plus, maintenez l’impédance interélectrode en dessous de trois kilos ohms.
Pour l’enregistrement ABR, en fonction du matériel et du logiciel d’acquisition, assurez-vous de calibrer les niveaux sonores corrects sur les fréquences de stimulation utilisées. Maintenant, déplacez l’appareil de transducteur de son vers l’oreille active de l’animal et placez-le à une faible profondeur de deux millimètres dans le conduit auditif. Enfin, vérifiez l’animal pendant les tests.
Si les résultats semblent anormaux ou absents, repositionnez le transducteur sonore dans le conduit auditif. Tout d’abord, ouvrez le logiciel pour acquérir des enregistrements ABR. Définissez les limites supérieure et inférieure du rejet d’artefact à environ 25 microvolts, de sorte que l’animal, le mouvement ou le bruit pendant un balayage excluent ce balayage de l’analyse.
Recueillez au moins 1024 balayages pour obtenir une réponse moyenne qui peut être faite en deux enregistrements de 512 balayages chacun. Cela garantit que la réponse est un stimulus évoqué et reproductible. Dans les paramètres d’amplification du logiciel, réglez le gain sur 100 000, le filtre passe-bas sur 3 000 Hertz et le filtre passe-haut sur 100 Hertz.
Définissez le taux de présentation du stimulus entre 10 et 20 stimuli par seconde et la durée du stimulus de clic à 100 microsecondes. Ensuite, réglez la fréquence d’échantillonnage à 40 kilohertz, 25 microsecondes pour obtenir les meilleures données de résolution et réglez la polarisation du stimulus en alternance. Si vous enregistrez 512 balayages, combinez deux tests distincts pour créer une moyenne de balayage de 1 024 et continuez à enregistrer à des intensités de plus en plus faibles jusqu’à ce que le potentiel évoqué ne puisse plus être identifié.
Abaissez l’intensité du stimulus par paliers de cinq décibels pour trouver l’intensité de stimulus la plus faible qui suscite une réponse évoquée. Définissez le seuil ABR comme l’intensité de stimulus la plus faible qui suscite une réponse évoquée détectable. Après avoir euthanasié et décapité l’animal et l’expérience en nettoyant le coussin chauffant, la sonde rectale et les électrodes de chlorure d’argent avec des lingettes à 70% d’alcool isopropylique, assurez-vous que toutes les traces acquises ont été conservées.
Cette figure représente le clic ABR. La latence maximale de l’onde I a augmenté d’environ 0,3 milliseconde pour chaque diminution de 20 décibels de l’intensité du stimulus. L’onde I a également présenté la plus grande amplitude de crête et la plus faible variabilité de latence de crête de tous les pics de forme d’onde.
Le graphique montre le sursaut de tonalité évoqué par ABR. La meilleure réponse a été observée à 1 000 Hertz. La figure démontre que si la température corporelle n’est pas maintenue, les fonctions d’intensité de latence de l’ABR sont très variables et souvent inexactes.
La figure montre que les APR enregistrés chez les nouveau-nés de moins de trois heures, étiquetés P1, ont des latences de crête significativement prolongées et des amplitudes de crête réduites par rapport aux nouveau-nés plus âgés, étiquetés comme P2. La figure compare des traces de clic de niveau de pression acoustique de 75 décibels chez le même animal avec des emplacements d’électrodes de référence différents. L’amplitude du pic de l’onde II pour le placement mastoïdien s’est produite une milliseconde après le pic de l’onde II pour le placement du cou. Ce décalage horaire reflète probablement les sites de génération neuronale ABR par rapport au placement de l’électrode.
Les réponses entre les deux oreilles étaient similaires avec des changements mineurs dans les amplitudes de crête probablement dus au positionnement des écouteurs. La latence de l’oreille gauche et de l’oreille droite étant équivalente, elle soutient le fonctionnement tout aussi sain des deux oreilles et des hémisphères du tronc cérébral chez le poulet nouveau-né. Un placement correct du transducteur sonore peut faire la distinction entre de bons et aucun résultat.
L’ABR de poulet doit être robuste avec un bon rapport signal/bruit. Toutes les questions abordées par les études ABR chez d’autres espèces aviaires peuvent être appliquées au poulet. En outre, la recherche en physiologie moléculaire chez le poulet embryonnaire peut intégrer cette méthodologie in vivo.
