이 프로토콜은 임상 관련 방법론과 잘 정립 된 동물 연구 모델을 결합합니다. 그것은 유전자 조작에 따른 청각 발달 및 개선 및 청력의 기능적 변화에 관한 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 비 침습적이므로 수술이 필요하지 않으며 추가 실험과 결합 될 수 있습니다.
또한 수행하는 데 약 한 시간 밖에 걸리지 않습니다. 이 방법은 모든 작은 조류 종에 사용할 수 있습니다. 따라서 비교 생리학은 비교적 쉽습니다.
닭고기 ABR은 또한 유전자 조작에 따른 기능적 청력에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 수정 된 흰 다리 뿔 닭고기 알을 얻는 것으로 시작하십시오. 다음으로, 원하는 시험일 21 일 전에 섭씨 38도, 습도 50 %에서 난자를 배양하십시오.
계란이 부화되면 큰 계량 보트에 부드럽게 넣어 동물의 무게를 측정하십시오. 마취 주사 후, 동물을 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 그런 다음 목이 절뚝 거리고 포셉을 사용하여 동물의 발가락을 꼬집습니다.
다음 단계로 날개 깃털을 사용하여 닭의 성별을 결정하십시오. 나중에 면화 팁 어플리케이터가있는 탈모 크림을 머리와 목 부위, 특히 새의 귀 개구 근처에 바르십시오. 이제 70 % 이소프로필 알코올 물티슈를 사용하여 깃털, 남아있는 탈모 크림 및 머리와 목의 피부를 닦아냅니다.
또한, 피하 전극 및 직장 프로브를 70% 이소프로필 알코올 와이프를 사용하여 멸균한다. 동물을 사운드 격리 및 전기적으로 차폐 된 챔버에 배치하여 환경이 최상의 녹음을 위해 전기 및 음향 소음을 최소화하도록하십시오. 동물의 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 사용하십시오.
이제 직장 프로브를 삽입하고 동물의 머리를 제자리에 고정하거나 원치 않는 움직임을 피하기 위해 부리를 물체에 대고 휴식을 취하십시오. 다음으로 온도 조절 챔버가 동물의 온도를 섭씨 37도에서 41도 사이로 유지하는지 확인하십시오. 세 개의 스테인레스 스틸, 염화은의 바늘 전극을 참조, 활성 및 공통 접지 전극으로 사용하십시오.
각 전극을 두세 밀리미터의 피하에 머리에 넣었지만 두개골을 관통 할만큼 깊지는 않은 곳에 놓은 다음 전극을 피부 밖으로 찌르고 팁을 노출시킵니다. 단일 채널 녹화의 경우, 활성 전극을 두개골 위에 외이도만큼 멀리 떨어진 중앙선에 놓습니다. 자극이 전달될 귀 뒤에 기준 전극을 놓고 목의 대측 귀 뒤에 접지 전극을 놓습니다.
이제 전극 임피던스를 확인하십시오. 전체 전극 임피던스가 다섯 킬로 옴을 초과하지 않는지 확인하십시오. 또한 전극 간 임피던스를 세 킬로 옴 이하로 유지하십시오.
ABR 레코딩의 경우, 획득 하드웨어 및 소프트웨어에 따라 사용된 자극 주파수에서 올바른 사운드 레벨을 보정해야 합니다. 이제 사운드 트랜스듀서 장치를 동물의 활성 귀쪽으로 이동하고 외이도의 두 밀리미터의 얕은 깊이에 놓습니다. 마지막으로, 테스트 중에 동물을 확인하십시오.
결과가 비정상적이거나 없는 것처럼 보이면 외이도에 사운드 트랜스듀서를 재배치합니다. 먼저 소프트웨어를 열어 ABR 녹음을 가져옵니다. 아티팩트 제거 상한과 하한을 약 25마이크로볼트로 설정하여 스윕 중 동물, 움직임 또는 소음이 해당 스윕을 분석에서 제외하도록 합니다.
최소 1024개의 스윕을 수집하여 각각 512개의 스윕으로 구성된 두 번의 레코딩으로 수행할 수 있는 웅장한 평균 응답을 얻습니다. 이것은 반응이 자극을 불러 일으키고 반복 할 수 있도록합니다. 소프트웨어의 증폭기 설정에서 이득을 100, 000, 저역 통과 필터를 3, 000 헤르츠로, 하이 패스 필터를 100 헤르츠로 설정합니다.
초당 10~20회 자극 사이의 자극 표시 속도를 설정하고 클릭 자극의 지속 시간을 100마이크로초로 설정합니다. 다음으로, 최상의 분해능 데이터를 위해 샘플링 속도를 40킬로헤르츠, 25마이크로초로 설정하고 자극 분극을 교대로 설정합니다. 512 스윕을 기록하는 경우, 두 개의 개별 테스트를 결합하여 1, 024 스윕 평균을 생성하고, 유발된 전위를 더 이상 식별할 수 없을 때까지 더 낮거나 낮은 강도에서 기록을 계속하십시오.
다섯 데시벨 음압 레벨의 단계별로 자극 강도를 낮추어 자극 반응을 이끌어내는 가장 낮은 자극 강도를 찾습니다. ABR 역치를 검출 가능한 유발 반응을 유도하는 가장 낮은 자극 강도로 정의합니다. 동물을 안락사시키고 무력화 한 후 가열 패드, 직장 프로브 및 염화은의 전극을 70 % 이소프로필 알코올 물티슈로 청소하여 실험을 수행 한 후 획득 한 모든 흔적이 저장되었는지 확인하십시오.
이 수치는 클릭 ABR을 나타냅니다. 파동 I 피크 레이턴시는 자극 강도의 20데시벨 감소마다 약 0.3밀리초 증가하였다. Wave I은 또한 모든 파형 피크의 가장 큰 피크 진폭과 가장 낮은 피크 레이턴시 가변성을 제시했다.
그래프는 ABR을 불러 일으킨 톤 버스트를 보여줍니다. 가장 좋은 반응은 1, 000 헤르츠에서 볼 수 있었다. 이 그림은 체온이 유지되지 않으면 ABR의 대기 시간 강도 기능이 매우 가변적이며 종종 부정확하다는 것을 보여줍니다.
이 그림은 P1로 표시된 세 시간 미만의 해칭에서 기록 된 ABR이 P2로 표시된 오래된 부화에 비해 피크 대기 시간이 상당히 길어지고 피크 진폭이 감소했음을 보여줍니다. 이 그림은 동일한 동물의 75 데시벨 음압 레벨 클릭 트레이스를 다른 기준 전극 배치와 비교합니다. 유양돌기 배치를 위한 웨이브 II 피크 진폭은 목 배치에 대한 웨이브 II 피크 후 밀리초 후에 발생하였다. 이 시간차는 전극 배치에 상대적인 ABR 신경 생성 부위를 반영할 가능성이 높다.
두 귀 사이의 반응은 이어폰 위치 지정으로 인한 피크 진폭의 사소한 변화와 유사했습니다. 왼쪽 귀와 오른쪽 귀의 대기 시간은 부화 닭에서 귀와 뇌 줄기 반구의 똑같이 건강한 기능을 지원합니다. 올바른 사운드 트랜스듀서 배치는 양호한 결과와 무결과를 구분할 수 있습니다.
닭고기 ABR은 좋은 신호 대 잡음비로 견고해야합니다. 다른 조류 종의 ABR 연구에 의해 해결 된 모든 질문은 닭에 적용될 수 있습니다. 또한, 배아 닭의 분자 생리학 연구는 이것을 생체 내 방법론에 통합 할 수 있습니다.
