このプロトコルは、臨床的に関連する方法論と十分に確立された動物研究モデルを組み合わせたものです。これは、聴覚の発達と洗練、遺伝子操作後の聴覚の機能変化に関する質問に答えるのに役立ちます。この技術は非侵襲的であるため、手術を必要とせず、追加の実験と組み合わせることができます。
また、演奏には約1時間しかかかりません。この方法は、任意の小鳥種に使用することができます。したがって、比較生理学は比較的簡単です。
ニワトリABRはまた、遺伝子操作後の機能的聴覚への影響を評価することができる。受精した白いレッグホーン鶏の卵を取得することから始めます。次に、希望する試験日の21日前に、卵を摂氏38度、湿度50%で孵化させます。
卵が孵化したら、大きな計量ボートにそっと置いて動物を計量します。麻酔注射後、動物をインキュベーターに戻します。次に、首がぐったりしているかどうかを確認し、鉗子を使って動物のつま先をつまみます。
次のステップとして、羽の羽を使って鶏の性別を決定します。その後、綿の先端アプリケーターで脱毛クリームを頭頸部、特に鳥の耳の開口部の近くに塗布します。70%イソプロピルアルコールワイプを使用して、羽毛、残りの脱毛クリーム、頭と首の皮膚を拭き取ります。
また、70%イソプロピルアルコールワイプを用いて皮下電極及び直腸プローブを滅菌する。動物を遮音および電気的に遮蔽されたチャンバーに入れ、環境が最高の録音のために電気的および音響的ノイズを最小限に抑えていることを確認してください。動物の体温を維持するために加熱パッドを使用してください。
次に、直腸プローブを挿入し、動物の頭を所定の位置に固定するか、不要な動きを避けるためにくちばしを物体に押し付けます。次に、温度制御チャンバが動物の体温を摂氏37〜41度に維持することを確認します。3つのステンレス鋼、塩化銀ニードル電極を基準、アクティブ、および共通の接地電極として使用します。
各電極を頭部に皮下に2〜3ミリメートル置くが、頭蓋骨を貫通するほど深くはなく、電極を皮膚から突き出して先端を露出させる。シングルチャンネル録音の場合は、頭蓋骨の上の活性電極を外耳道の尾まで正中線に配置します。刺激が送られる耳の後ろに参照電極を置き、首の反対側の耳の後ろに接地電極を置きます。
次に、電極インピーダンスを確認します。電極全体のインピーダンスが5キロオームを超えないようにします。また、電極間インピーダンスを3キロオーム以下に維持してください。
ABR録音では、集録ハードウェアとソフトウェアに応じて、使用する刺激周波数全体で正しいサウンドレベルを校正してください。次に、音響トランスデューサ装置を動物の活動的な耳に向かって動かし、外耳道の2ミリメートルの浅い深さに置きます。最後に、試験中に動物をチェックしてください。
結果が異常または存在しないと思われる場合は、外耳道に音響探触子を再配置します。まず、ソフトウェアを開いてABR録音を取得します。アーティファクト除去の上限と下限を約 25 マイクロボルトに設定して、スイープ中の動物、移動、またはノイズによってそのスイープが解析から除外されるようにします。
少なくとも1024回のスイープを収集して、それぞれ512回のスイープの2つの記録で実行できる総平均応答を取得します。これにより、応答が刺激され、反復可能であることが保証されます。ソフトウェアのアンプ設定で、ゲインを100,000、ローパスフィルタを3,000ヘルツ、ハイパスフィルタを100ヘルツに設定します。
刺激の提示速度を 1 秒あたり 10 ~ 20 刺激に設定し、クリック刺激の持続時間を 100 マイクロ秒に設定します。次に、サンプリングレートを40キロヘルツ、25マイクロ秒に設定して最高の分解能データを取得し、刺激偏光を交互に設定します。512 回の掃引を記録する場合は、2 つの別々のテストを組み合わせて 1, 024 掃引平均を作成し、誘発された電位が識別できなくなるまで、より低い強度で記録を続けます。
刺激強度を5デシベルの音圧レベルのステップで下げて、誘発された応答を引き出す最も低い刺激強度を見つけます。ABR閾値を、検出可能な誘発応答を惹起する最も低い刺激強度として定義する。動物を安楽死させて断頭した後、加熱パッド、直腸プローブ、および塩化銀電極を70%イソプロピルアルコールワイプで洗浄して実験を行い、取得した痕跡がすべて保存されていることを確認してください。
この図はクリック ABR を表しており、Wave I のピーク待ち時間は、刺激強度が 20 デシベル減少するごとに約 0.3 ミリ秒増加しました。波Iはまた、すべての波形ピークの最大のピーク振幅と最小のピークレイテンシ変動性も提示した。
グラフは、ABR を誘発したトーン バーストを示しています。最良の応答は1,000ヘルツで見られました。この図は、体温が維持されない場合、ABRの潜伏強度関数は非常に可変であり、しばしば不正確であることを示している。
この図は、P1とラベル付けされた3時間未満の孵化子から記録されたABRは、P2とラベル付けされた古い孵化子と比較して、ピークレイテンシーが有意に延長され、ピーク振幅が減少することを示している。この図は、異なる参照電極配置を有する同じ動物における75デシベルの音圧レベルクリックトレースを比較したものである。乳房配置のための波IIピーク振幅は、頸部配置のための波IIピークの1ミリ秒後に発生した。この時間差は、電極配置に対するABR神経生成の部位を反映している可能性が高い。
2つの耳の間の応答は類似しており、ピーク振幅のわずかな変化はイヤホンの位置に起因する可能性が高い。左右の耳の潜伏が同等であることは、孵化鶏の耳と脳幹半球の両方の等しく健康な機能をサポートします。音響探触子を正しく配置することで、良好な結果とまったく結果を区別できます。
チキンABRは、良好な信号対雑音比で堅牢でなければなりません。他の鳥類種のABR研究によって対処されたすべての質問は、鶏に適用することができます。また、ニワトリの胚における分子生理学研究は、この生体内方法論を取り入れることができる。
