Dieses Protokoll kombiniert eine klinisch relevante Methodik mit einem etablierten Tierversuchsmodell. Es wird helfen, Fragen zur auditiven Entwicklung und Verfeinerung sowie zu funktionellen Veränderungen des Gehörs nach genetischer Manipulation zu beantworten. Diese Technik ist nicht-invasiv, so dass sie keine Operation erfordert und mit zusätzlichen Experimenten kombiniert werden kann.
Außerdem dauert es nur etwa eine Stunde, um aufzutreten. Diese Methode könnte bei jeder kleinen Vogelart angewendet werden. Die vergleichende Physiologie ist also relativ einfach.
Die Hühner-ABR kann auch die Wirkung auf das funktionelle Gehör nach genetischer Manipulation bewerten. Beginnen Sie mit dem Erwerb von befruchteten weißen Leghorn-Hühnereiern. Als nächstes inkubieren Sie das Ei bei 38 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von 50% für 21 Tage vor dem gewünschten Testtermin.
Sobald das Ei geschlüpft ist, wiegen Sie das Tier, indem Sie es vorsichtig in ein großes Wiegeboot legen. Nach der Anästhesieinjektion das Tier wieder in den Inkubator geben. Überprüfen Sie dann, ob der Hals schlaff ist und kneifen Sie den Zeh des Tieres mit einer Pinzette zusammen.
Als nächsten Schritt bestimmen Sie das Geschlecht des Huhns mit seinen Flügelfedern. Später enthaarende Creme mit einem Baumwollspitzenapplikator auf den Kopf- und Halsbereich auftragen, besonders in der Nähe der Ohröffnung für den Vogel. Verwenden Sie nun 70% Isopropylalkohol-Tücher, um Federn, verbleibende Enthaarungscreme und die Haut an Kopf und Hals abzuwischen.
Sterilisieren Sie auch die subdermalen Elektroden und die rektale Sonde mit einem 70% Isopropylalkohol-Tuch. Platzieren Sie das Tier in einer schallisolierten und elektrisch abgeschirmten Kammer, um sicherzustellen, dass die Umgebung minimale elektrische und akustische Geräusche für die besten Aufnahmen aufweist. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur des Tieres aufrechtzuerhalten.
Setzen Sie nun die rektale Sonde ein und fixieren Sie den Kopf des Tieres oder legen Sie den Schnabel gegen einen Gegenstand, um unerwünschte Bewegungen zu vermeiden. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Temperaturkontrollkammer die Temperatur des Tieres zwischen 37 und 41 Grad Celsius hält. Verwenden Sie drei Edelstahl-, Silberchlorid-Nadelelektroden als Referenz-, Aktiv- und Common-Ground-Elektroden.
Legen Sie jede Elektrode subdermal zwei bis drei Millimeter in den Kopf, aber nicht tief genug, um den Schädel zu durchdringen, und stecken Sie dann die Elektrode aus der Haut und legen Sie die Spitze frei. Für die einkanalige Aufnahme platzieren Sie die aktive Elektrode über dem Schädel an der Mittellinie so weit kaudal wie der Gehörgang. Platzieren Sie die Referenzelektrode hinter dem Ohr, wo der Reiz abgegeben wird, und platzieren Sie die Bodenelektrode hinter dem kontralateralen Ohr im Nacken.
Überprüfen Sie nun die Elektrodenimpedanz. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtimpedanz der Elektrode fünf Kilo Ohm nicht überschreitet. Halten Sie auch die Interelektrodenimpedanz unter drei Kilo Ohm.
Achten Sie bei ABR-Aufnahmen je nach Erfassungshardware und -software darauf, die richtigen Schallpegel über die verwendeten Reizfrequenzen hinweg zu kalibrieren. Bewegen Sie nun den Schallwandlerapparat in Richtung des aktiven Ohres des Tieres und platzieren Sie ihn in einer geringen Tiefe von zwei Millimetern im Gehörgang. Überprüfen Sie schließlich das Tier während des Tests.
Wenn die Ergebnisse abnormal aussehen oder fehlen, positionieren Sie den Schallwandler im Gehörgang neu. Öffnen Sie zunächst die Software, um ABR-Aufnahmen zu erfassen. Legen Sie die oberen und unteren Grenzwerte für die Artefaktabweisung auf etwa 25 Mikrovolt fest, sodass Tiere, Bewegungen oder Geräusche während eines Sweeps diesen Sweep von der Analyse ausschließen.
Sammeln Sie mindestens 1024 Sweeps, um eine große durchschnittliche Antwort zu erhalten, die in zwei Aufzeichnungen von jeweils 512 Sweeps durchgeführt werden kann. Dies stellt sicher, dass die Reaktion ein Reiz ist, der hervorgerufen und wiederholbar ist. Stellen Sie in den Verstärkereinstellungen der Software die Verstärkung auf 100.000, den Tiefpassfilter auf 3.000 Hertz und den Hochpassfilter auf 100 Hertz ein.
Stellen Sie die Stimulus-Präsentationsrate zwischen 10 und 20 Stimuli pro Sekunde und die Zeitdauer des Klick-Stimulus auf 100 Mikrosekunden ein. Stellen Sie als Nächstes die Abtastrate auf 40 Kilohertz, 25 Mikrosekunden für die Daten mit der besten Auflösung ein und stellen Sie die Reizpolarisation auf abwechselnd ein. Wenn Sie 512 Sweeps aufzeichnen, kombinieren Sie zwei separate Tests, um einen Sweep-Durchschnitt von 1.024 zu erstellen, und fahren Sie mit der Aufzeichnung bei niedrigeren und niedrigeren Intensitäten fort, bis das evozierte Potenzial nicht mehr identifiziert werden kann.
Senken Sie die Stimulusintensität um Schritte von fünf Dezibel Schalldruckpegel, um die niedrigste Reizintensität zu finden, die eine hervorgerufene Reaktion hervorruft. Definieren Sie den ABR-Schwellenwert als die niedrigste Reizintensität, die eine nachweisbare evozierte Reaktion hervorruft. Stellen Sie nach dem Einschläfern und Enthaupten des Tieres und des Experiments durch Reinigen des Heizkissens, der Rektalsonde und der Silberchloridelektroden mit 70% Isopropylalkoholtüchern sicher, dass alle erworbenen Spuren gespeichert wurden.
Diese Abbildung stellt die Klick-ABR dar. Die Spitzenlatenz der Welle I stieg um etwa 0,3 Millisekunden pro 20 Dezibel Abnahme der Stimulusintensität. Welle I zeigte auch die größte Peakamplitude und die niedrigste Peak-Latenzvariabilität aller Wellenform-Peaks.
Die Grafik zeigt den Tonausbruch, der ABR hervorgerufen hat. Die beste Resonanz wurde bei 1.000 Hertz gesehen. Die Abbildung zeigt, dass, wenn die Körpertemperatur nicht eingehalten wird, die Latenzintensitätsfunktionen des ABR sehr variabel und oft ungenau sind.
Die Abbildung zeigt, dass ABRs, die von weniger als drei Stunden alten Jungtieren aufgezeichnet wurden und als P1 bezeichnet werden, Spitzenlatenzen aufweisen, die im Vergleich zu älteren Jungtieren, die als P2 bezeichnet werden, signifikant verlängert und die Spitzenamplituden reduziert haben. Die Abbildung vergleicht 75 Dezibel Schalldruckpegel-Klickspuren im selben Tier mit unterschiedlichen Referenzelektrodenplatzierungen. Die Peakamplitude der Welle II für die Mastoidplatzierung trat eine Millisekunde nach dem Peak der Welle II für die Halsplatzierung auf. Dieser Zeitunterschied spiegelt wahrscheinlich die Orte der neuronalen ABR-Erzeugung relativ zur Elektrodenplatzierung wider.
Die Reaktionen zwischen den beiden Ohren waren ähnlich mit geringfügigen Änderungen der Spitzenamplituden wahrscheinlich aufgrund der Kopfhörerpositionierung. Die Latenz des linken und rechten Ohrs, die gleichwertig ist, unterstützt die gleichermaßen gesunde Funktion von Ohren und Hirnstammhemisphären beim Junghuhn. Die richtige Platzierung des Schallwandlers kann zwischen guten und keinen Ergebnissen unterscheiden.
Der Hühner-ABR sollte robust sein und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen. Alle Fragen, die durch ABR-Studien an anderen Vogelarten beantwortet werden, können auf das Huhn angewendet werden. Auch die molekularphysiologische Forschung an embryonalen Hühnern kann diese In-vivo-Methodik einbeziehen.
