Этот протокол сочетает в себе клинически значимую методологию с хорошо зарекомендовавшей себя моделью исследования на животных. Это поможет ответить на вопросы о развитии и уточнении слуха и функциональных изменениях слуха после генетических манипуляций. Этот метод является неинвазивным, поэтому он не требует хирургического вмешательства и может быть объединен с дополнительными экспериментами.
Кроме того, это занимает всего около часа, чтобы выполнить. Этот метод может быть использован на любом мелком виде птиц. Таким образом, сравнительная физиология относительно проста.
Куриный ABR также может оценить влияние на функциональный слух после генетических манипуляций. Начните с приобретения оплодотворенных белых куриных яиц леггорн. Далее инкубируют яйцо при 38 градусах Цельсия и влажности 50% в течение 21 дня до желаемой даты тестирования.
Как только яйцо вылупится, взвесьте животное, осторожно поместив его в большую весовую лодку. После инъекции анестезии поместите животное обратно в инкубатор. Затем проверьте, не хромает ли шея и ущипните палец животного с помощью щипцов.
В качестве следующего шага определите пол курицы, используя ее перья крыла. Позже нанесите крем для депиляции с ватным аппликатором на область головы и шеи, особенно возле отверстия уха для птицы. Теперь используйте 70% изопропиловые спиртовые салфетки, чтобы вытереть перья, любой оставшийся крем для депиляции и кожу на голове и шее.
Кроме того, стерилизуйте подкожные электроды и ректальный зонд с помощью 70% изопропиловой спиртовой салфетки. Поместите животное в звукоизоляцию и электрически защищенную камеру, гарантируя, что окружающая среда имеет минимальный электрический и акустический шум для лучших записей. Используйте грелку для поддержания температуры тела животного.
Теперь вставьте ректальный зонд и зафиксируйте голову животного на месте или упирайтесь клювом в предмет, чтобы избежать нежелательного движения. Затем убедитесь, что камера контроля температуры поддерживает температуру животного между 37 и 41 градусом цельсия. Используйте три игольчатых электрода из нержавеющей стали и хлорида серебра в качестве эталонных, активных и общих электродов.
Поместите каждый электрод подкожно на два-три миллиметра в голову, но недостаточно глубоко, чтобы проникнуть в череп, а затем высуньте электрод из кожи, обнажив кончик. Для одноканальной записи поместите активный электрод над черепом на средней линии до каудального канала. Поместите опорный электрод за ухом, куда будет доставлен стимул, и поместите заземляющий электрод за контралатеральным ухом в шее.
Теперь проверьте сопротивление электрода. Убедитесь, что общее сопротивление электрода не превышает пяти килоОм. Кроме того, поддерживайте межэлектродное сопротивление ниже трех килограмм Ом.
Для записи ABR, в зависимости от аппаратного и программного обеспечения для сбора, обязательно откалибруйте правильные уровни звука по используемым частотам стимулов. Теперь переместите звуковой преобразователь в сторону активного уха животного и поместите его на небольшую глубину в два миллиметра в ушной канал. Наконец, проверьте на животном во время тестирования.
Если результаты выглядят ненормальными или отсутствуют, переместите звуковой преобразователь в ушной канал. Во-первых, откройте программное обеспечение для получения записей ABR. Установите верхний и нижний пределы отклонения артефакта примерно на 25 микровольт, так что животное, движение или шум во время развертки исключат эту развертку из анализа.
Соберите не менее 1024 разверток, чтобы получить большой усредненный ответ, который можно сделать в двух записях по 512 разверток в каждой. Это гарантирует, что реакция является стимулом вызванной и воспроизводимой. В настройках усилителя программного обеспечения установите коэффициент усиления на 100 000, фильтр нижних частот на 3 000 Гц, а фильтр высоких частот на 100 Гц.
Установите скорость представления стимула между 10 и 20 стимулами в секунду, а продолжительность времени стимула щелчка до 100 микросекунд. Затем установите частоту дискретизации на 40 килогерц, 25 микросекунд для получения наилучших данных о разрешении и установите поляризацию стимула на чередование. При записи 512 разверток объедините два отдельных теста, чтобы создать среднее значение развертки 1024, и продолжайте запись с все меньшей и меньшей интенсивностью до тех пор, пока вызванный потенциал больше не может быть идентифицирован.
Уменьшите интенсивность стимула с шагом уровня звукового давления в пять децибел, чтобы найти самую низкую интенсивность стимула, которая вызывает вызванную реакцию. Определите порог АБР как самую низкую интенсивность стимула, которая вызывает обнаруживаемый вызванный ответ. После усыпления и обезглавливания животного и эксперимента путем очистки грелки, ректального зонда и электродов хлорида серебра с 70% изопропиловым спиртом, убедитесь, что все приобретенные следы были сохранены.
Эта цифра представляет собой пиковую задержку волны I, увеличенную примерно на 0,3 миллисекунды для каждого снижения интенсивности стимула на 20 децибел. Волна I также представила наибольшую амплитуду пика и самую низкую изменчивость задержки пика среди всех пиков формы волны.
На графике показан тональный всплеск, вызванный ABR. Лучший ответ был замечен при 1000 Гц. Рисунок показывает, что если температура тела не поддерживается, функции интенсивности латентности ABR сильно варьируются и часто неточны.
Рисунок показывает, что ABR, зарегистрированные у птенцов в возрасте менее трех часов, помеченных как P1, имеют пиковые задержки значительно удлинения и пиковые амплитуды уменьшены по сравнению с более старыми детенышами, помеченными как P2. На рисунке сравниваются 75 децибел уровня звукового давления, следы щелчка в одном и том же животном с различным расположением опорных электродов. Пиковая амплитуда волны II для размещения сосцевидной части произошла через одну миллисекунду после пика волны II для размещения шеи. Эта разница во времени, вероятно, отражает участки нейронной генерации ABR относительно размещения электрода.
Ответы между двумя ушами были похожи с незначительными изменениями пиковых амплитуд, вероятно, из-за позиционирования наушников. Латентность левого и правого уха, будучи эквивалентными, поддерживает одинаково здоровую функцию как ушей, так и полушарий ствола мозга у птенца. Правильное размещение звукового преобразователя может отличить хорошие результаты от отсутствия.
Куриный ABR должен быть прочным с хорошим отношением сигнал/шум. Все вопросы, затронутые исследованиями ABR у других видов птиц, могут быть применены к курице. Кроме того, исследования молекулярной физиологии эмбриональной курицы могут включать эту методологию in vivo.
