Cette méthode génère une empreinte digitale cardiolipine des leucocytes par spectrométrie de masse MALDI-TOF et permet de mesurer le rapport entre la monolysocardiolipine et la cardiolipine pour un diagnostic rapide du syndrome de Barth. Le principal avantage de cette technique est la détection d’espèces de lipides diagnostiques par un seul tour de spectrométrie de masse immédiatement après l’isolement des leucocytes d’un millilitre de sang. Ceux-ci, ainsi que la sensibilité et la spécificité oculaires, font de ce test un test de diagnostic approprié à intégrer dans le travail de routine des laboratoires cliniques pour dépister le syndrome de Barth.
Commencez par placer des échantillons de sang sur un agitateur orbital pendant 10 minutes. Ensuite, à 0,9 millilitre de sang total dans un tube de 1,5 millilitre, ajoutez 0,1 millilitre de 20% de dextran. Maintenant, pipettez et dispersez doucement la suspension 20 fois tout en évitant les bulles d’air et laissez les globules rouges sédimenter pendant environ une heure à température ambiante.
À l’aide d’une seringue, prélever et transférer le surnageant jaune dans un tube de 15 millilitres, puis centrifuger à 400 fois G pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille contenant principalement des leucocytes et des globules rouges résiduels dans 0,6 millilitre d’eau double distillée glacée. Après environ 15 secondes, ajouter 0,2 millilitre de chlorure de potassium 0,6 molaire à la suspension cellulaire pour rétablir l’osmolarité correcte.
Le court choc osmotique va lyser les globules rouges et laisser les leucocytes intacts. Réglez ensuite le volume final à 2,5 millilitres avec un PBS à simple intensité. Ensuite, centrifugez la suspension à 400 fois G pendant 15 minutes à température ambiante.
Ceci est suivi par l’élimination du surnageant et le lavage de la pastille de leucocyte avec 2,5 millilitres de PBS à force unique. Répéter la centrifugeuse et jeter le surnageant comme décrit précédemment et remettre en suspension la pastille contenant des leucocytes dans 200 microlitres d’eau stérilisée double distillée. Congelez la suspension à moins 80 degrés Celsius ou effectuez directement l’extraction des lipides.
Commencez l’extraction en transférant 20 microlitres de suspension de leucocytes dans un tube de 1,5 millilitre et tournez à 16 000 fois G pendant 30 secondes. Après avoir jeté le surnageant, ajouter 10 microlitres de chloroforme à la pastille restante et pipeter à plusieurs reprises pour favoriser l’extraction des lipides. Maintenant, ajoutez 10 microlitres de solution de matrice de 9-aminoacridine à la pastille dans le chloroforme.
Pipette et dispersion répétée pour mélanger. Faire tourner la solution contenant des lipides et du chloroforme et une solution matricielle de 9-aminoacridine à 16 000 fois G pendant 30 secondes. Enfin, déposez le surnageant sous forme de gouttelettes de 0,35 microlitre sur la cible MALDI à analyser et laissez sécher les gouttelettes à l’air libre pendant au moins 10 à 15 minutes.
Pour l’analyse des lipides, acquérir les spectres de masse des échantillons en triples sur un spectromètre de masse MALDI-TOF. Après étalonnage avec des étalons lipidiques, réglez les analyses en mode ion négatif et optimisez le rapport masse/charge de détection allant de 200 thomson à 2 000 thomson pour l’analyse de petites molécules. Gardez la fluence laser 5% au-dessus du seuil pour avoir un bon rapport signal/bruit.
Pour chaque spectre de masse, appliquez en moyenne 2 000 tirs laser simples. Acquérir du spectre en mode réflecteur en utilisant l’extraction pulsée retardée. Appliquez une suspension matricielle fermée à 400 thomson pour éviter la saturation du détecteur.
La figure montre que les défauts du gène TAFAZZIN déterminent généralement un profil lipidique spécifique au syndrome de Barth indiqué par l’apparition de formes de monolysocardiolipine et de cardiolipine immature ainsi que par la réduction des formes cardiolipines matures dans l’empreinte cardiolipine. En outre, la figure montre également que les analyses MALDI-TOF/MS des leucocytes de sujets témoins ne présentent généralement que deux espèces de cardiolipine mature. La figure montre que la monolysocardiolipine plus cardiolipine immature sur le rapport cardiolipine mature chez les patients atteints du syndrome de Barth était plus élevée que chez les sujets sains et les patients souffrant d’insuffisance cardiaque.
Ici, les groupes témoins et les patients atteints du syndrome de Barth sont séparés par plus d’un ordre de grandeur, ce qui montre que cette méthode a une forte capacité de diagnostic pour le syndrome de Barth. Pour assurer un bon résultat de dosage, il est crucial de suivre attentivement toutes les étapes du protocole, de l’isolement des leucocytes au calcul du rapport monolysocardiolipine/cardiolipine. La spectrométrie de masse MALDI-TOF est utile pour obtenir des profils lipidiques de petites quantités de divers échantillons biologiques afin d’identifier des biomarqueurs lipidiques ou des altérations pathologiques.
