Le poisson-zèbre est un modèle attrayant, mais les scientifiques ne savent pas combien l’organisme absorbe avec le dosage à base d’eau. Nous avons développé une technique pour digérer les tissus après exposition et quantifier les métaux via ICPMS. Cette technique nous permet de quantifier et de valider avec précision la réponse dose à l’aide de l’ICPMS.
Cette méthode a beaucoup de potentiel. Les expositions pharmacologiques ou environnementales aux métaux peuvent être appliquées du niveau cellulaire jusqu’à des systèmes d’organes entiers dans des modèles animaux. Ajouter environ 0,25 millilitre d’acide nitrique de haute pureté aux tubes centrifuges en polypropylène de 15 millilitres pour un maximum de 10 larves.
Ultrasons pendant une heure pour prédigérer les échantillons. Pour les ultrasons, effectuez de courts cycles de digestion des tissus à intervalles de cinq minutes dans un digesteur à micro-ondes sans danger pour l’acide jusqu’à ce que tous les tissus soient visiblement oxydés, produisant une solution jaune uniforme et claire. Surveillez attentivement l’intégrité des tubes pour éviter toute rupture et effectuez de courtes rotations dans la centrifugeuse entre les cycles.
Une fois que le tissu est visiblement oxydé, diluer les échantillons dans une hotte à 3,5% d’acide nitrique en utilisant 6,75 millilitres d’eau de haute pureté et de vortex pour bien mélanger. Ensuite, pour effectuer une courbe d’étalonnage à 7 points appariée par matrice pour tenir compte de toute interférence isobare potentielle. En utilisant une concentration en stock de l’étalon élémentaire certifié aqueux, prenez une aliquote de 0,1 millilitre et, par pipette, dans un nouveau tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Diluer avec de l’acide nitrique à 3,5% jusqu’à un volume final de 10 millilitres pour produire 10 parties par milliard de solutions étalons. En utilisant les 10 parties par milliard de stock, faites les dilutions en série 0,1, 1,0 et 5,0 parties par milliard de solutions standard dans de l’acide nitrique à 3,5%. En utilisant le stock 0,1, faites les dilutions en série 0,001, 0,005 et 0,01 parties par milliard de solutions étalons dans de l’acide nitrique à 3,5%.
Ensuite, avant de préparer l’instrument ICPMS pour l’analyse des échantillons, assurez-vous que la vanne de gaz argon est ouverte, que tous les tubes sont bien connectés et propres, que l’acide nitrique à 5% est ouvert pour le rinçage des tubes et de la verrerie entre les analyses d’échantillons. Vérifiez l’état de la torche et des cônes et assurez-vous que la boîte de la torche est bien verrouillée. Et le tube de drainage de la chambre de pulvérisation est correctement connecté à la péripompe.
Ouvrez le logiciel, vérifiez les lectures de vide et assurez-vous que toutes les turbopompes fonctionnent à 100% Cliquez sur DÉMARRER dans la fenêtre d’état du système Plasma Control pour lancer la séquence de démarrage. Allumez la pompe à plasma et le refroidisseur de plasma, perchez le nébuliseur et allumez le plasma. Attendez que le plasma soit allumé et stable lorsque la fenêtre État indique que la séquence de démarrage est terminée.
À ce stade, observez les points verts sur la fenêtre d’état du système qui indiquent que tous les blocs d’alimentation sont allumés. Dans la barre de menus, cliquez sur Contrôle, Échantillonneur automatique dans le menu déroulant. Entrez dans la position du rack d’échantillonneur automatique pour le tube contenant 5% d’acide nitrique, laissez l’acide pénétrer dans le plasma.
Dans la barre de menus, cliquez sur Scans, Magnet dans le menu déroulant. Dans la fenêtre MagnetScan, tapez 115 dans la position de masse du marqueur et cliquez sur Entrée. Laissez l’aimant balayer la plage de masse pendant 30 minutes pendant que l’instrument se réchauffe.
Après 30 minutes, utilisez la commande d’échantillonneur automatique pour passer à la position d’une solution de réglage multi-éléments d’une partie par milliard. Aspirez la solution d’accord et accordez l’instrument pour optimiser la lecture du signal. Ajustez la position de la torche pour les coordonnées X, Y, Z, de sorte que la torche s’aligne avec le centre des cônes et le débit du nébuliseur dans la fenêtre De contrôle du plasma.
Effectuez les ajustements nécessaires dans la fenêtre Réglage de l’optique ionique pour la source, le détecteur et l’analyseur. Une fois la lecture du signal optimisée, cliquez sur Arrêter dans la fenêtre Magnet Scan, cliquez sur Calibrer l’aimant et sélectionnez une basse résolution dans la fenêtre contextuelle. Cliquez sur OK et ouvrez le fichier smc d’étalonnage de masse pour calibrer l’aimant.
Cliquez sur Enregistrer, Utiliser pour appliquer l’étalonnage actuel de l’aimant aux analyses. Lorsque vous mesurez des échantillons inconnus avec une vaste gamme de concentrations, effectuez un étalonnage de détecteur pour comparer les signaux de comptage d’impulsions ioniques à de faibles concentrations aux signaux ioniques atténués produits à des concentrations plus élevées. Lancez l’analyse de l’échantillon en cliquant sur Acquisition de données, puis cliquez sur Configuration de la méthode dans le menu déroulant.
Utilisez une méthode existante fournie par le fabricant ou créez une méthode basée sur les éléments d’intérêt. Si nécessaire, ajustez le mode d’analyse, le temps d’arrêt, le délai de commutation, le nombre de balayages et de cycles, la résolution, le mode de détection et la masse de stationnement pour les paramètres du déflecteur. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les paramètres de la méthode.
Optimisez les paramètres pour chaque métal et isotype. Dans la barre de menus, cliquez sur Acquisition de données. Cliquez sur Batch Run dans le menu déroulant.
Vous pouvez également cliquer sur l’icône BATCH sous la barre de menus, importer les paramètres de lot à partir d’une feuille de calcul ou créer une séquence dans la fenêtre Batch Run. Entrez le type d’échantillon, la position du rack d’échantillonneur automatique, le temps de transfert, le temps de lavage, les répliques, l’ID d’échantillon et le fichier de méthode. Organisez l’exécution du lot pour obtenir des solutions standard pour la courbe d’étalonnage, suivie d’une norme de contrôle de la qualité, puis d’échantillons inconnus.
Surveiller la dérive de l’instrument et la reproductibilité des échantillons en incluant une norme de contrôle de la qualité de 0,5 partie par milliard tous les 5 à 10 échantillons. Des études sur l’absorption tissulaire ont été menées avec des expositions à l’eau au cisplatine et à un nouveau composé anticancéreux à base de ruthénium PMC79. La létalité et l’éclosion retardée ont été évaluées pour les concentrations nominales de cisplatine.
0, 3,75, 7,5 15, 30 et 60 milligrammes par litre de cisplatine. L’accumulation de platine dans les tissus de l’organisme a été déterminée par l’analyse ICPMS et le tissu de l’organisme contenait des doses respectives de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 et 461,9 nanogrammes par organisme. Un retard d’éclosion a été observé à toutes les concentrations de cisplatine.
Après la déchorionation, les chorions ont été collectés et analysés séparément pour le platine. Les doses non létales de cisplatine utilisées pour les études de déchorionation ont déterminé que 93 à 96% de la dose totale délivrée de cisplatine s’étaient accumulées dans le chorion, la dose restante dans le tissu larvaire. Les larves de poisson zèbre ont été exposées à 0, 3,1, 6,2, 9,2 et 12,4 milligrammes par litre de PMC79.
Ces concentrations ont été déterminées analytiquement pour contenir 0, 0,17, 0,44, 0,66 et 0,76 milligrammes par litre de ruthénium. Contrairement à ce cisplatine, l’éclosion retardée n’a pas été observée chez les larves exposées au PMC79. Les chorions n’ont pas été inclus dans l’analyse du ruthénium car ils se sont naturellement dégradés avant la collecte des larves.
Le métal massif dans les tissus larvaires analysés à chaque concentration était de 0,19, 0,41 et 0,68 nanogramme de ruthénium par larve. Tous les réactifs ajoutés au protocole d’exposition donnent le potentiel d’interférences isobares. Dans la mesure du possible, envisagez des alternatives comme le refroidissement rapide par rapport à la tricaïne.
Cette méthode permet de quantifier la dose de métal pour la toxicité, l’efficacité et les expériences à comparer avec des vertébrés supérieurs. Nous étions particulièrement enthousiastes à l’idée que notre dose seuil se situait dans un ordre de grandeur donné aux patients.
