Une limitation majeure de la microscopie à expansion est le ralentissement de la fluorescence après polymérisation et digestion. La microscopie à expansion de rétention d’étiquettes, nous l’appelons LR-ExM, utilise des ancrages trifonctionnels, qui sont dans le but de polymérisation et de digestion. Après avoir utilisé l’ancrage trifonction, nous introduisons la fluorescence après l’étape d’expansion.
Nous gardons donc un bon rapport signal sur bruit tout en ayant une haute résolution. La microscopie à expansion de rétention d’étiquettes peut être combinée avec toute autre microscopie à expansion précédemment introduite, ainsi qu’avec des microscopies fluorescentes. Il est très robuste dans la méthode polyvalente.
Et pour l’imagerie à haute régulation, il est vraiment important d’avoir un signal amélioré. Pour commencer, cultivez des cellules sur un verre de couverture chambré amovible de 16 puits avec un milieu complet à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Une fois que le nombre de cellules atteint environ 40 000, fixer les cellules avec 100 microlitres de 3,2% PFA dans un tampon PEM pendant 10 minutes à température ambiante.
Perméabilisez ensuite les cellules avec les 100 microlitres de tampon de perméablisation à température ambiante pendant 15 minutes. Incuber les cellules avec la solution de streptavidine diluée dans un tampon de blocage cellulaire pendant 15 minutes à température ambiante, puis rincer brièvement avec 200 microlitres de tampon de blocage cellulaire. Ensuite, incuber les cellules avec 100 microlitres de solution de biotine diluée dans un tampon de blocage cellulaire pendant 15 minutes à température ambiante.
Ensuite, incuber des cellules avec 100 microlitres de solution d’anticorps primaire contenant un anticorps anti-tubuline alpha de rat et un anticorps à chaîne lourde anti-clathrine de lapin pendant 16 heures à quatre degrés Celsius ou une heure à température ambiante. Incuber ensuite les cellules avec 100 microlitres de solution d’anticorps secondaire contenant trois ancrages fonctionnels, âne anti lapin creuser MA et âne anti rat biotine MA pendant une heure à température ambiante. Incuber des cellules avec 100 microlitres de glutaraldéhyde à 0,25% pendant 15 minutes à température ambiante afin d’ancrer les protéines sur l’hydrogel.
Retirez la structure supérieure de la plaque de 16 puits avec la lame de rasoir ou tout autre outil de retrait de votre choix et conservez le verre du couvercle inférieur. Placez le verre de couverture dans une boîte de Petri et placez-les sur de la glace. Ajouter 45 microlitres d’une solution de monomère à chaque puits pour conditionner les cellules.
Incuber sur la glace pendant cinq minutes. Pour fabriquer la solution de gélification, préparez un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Mélanger le monomère, l’eau distillée double et 10% T med.
N’ajoutez pas encore l’ammonium par sulfate. Pendant ce temps, gardez le tube de solution de gélification sur la glace. Ajouter 10% de persulfate d’ammonium à la solution de gélification.
Pipeter immédiatement 40 microlitres de solution de gélification sur chaque puits tout en stockant un tube de solution de gélification sur de la glace. Placez la plaque de puits sur de la glace pendant trois minutes de plus. Pour garder l’humidité du gel pendant l’incubation de 37 degrés Celsius, couvrez la boîte de Petri avec le couvercle et mettez quelques gouttes d’eau dans la boîte de Pétri.
Tout en protégeant l’échantillon de la lumière, déplacez le verre de couverture et la boîte de Petri de 10 centimètres dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure pour la gélification. Après la gélification, coupez le verre de couverture pour séparer chaque gel. Transférer les gels dans six plaques de puits.
Ajouter deux millilitres de tampon de digestion à chaque puits. Laissez les échantillons toute la nuit à température ambiante ou pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les gels avec au moins 10 fois le volume d’eau excédentaire par rapport au volume final du gel tout en répétant l’étape de lavage quatre fois pendant 20 à 30 minutes à chaque fois, et le gel se dilate d’environ quatre fois dans chaque dimension.
Incuber des gels dans un volume de deux millilitres de tampon de coloration de la digoxigénine de streptavidine avec deux à cinq colorants micromolaires de streptavidine et / ou un colorant anti-digoxigénine pendant 24 heures à température ambiante tout en gardant les échantillons dans l’obscurité. Ensuite, lavez et étendez le gel deux à quatre fois avec de l’eau excessive. Chaque lavage dure environ 30 minutes à une heure.
Pour faciliter la visualisation des cellules sous microscopie fluorescente, colorez les cellules avec DAPI lors du troisième lavage. Diluer le stock de DAPI dans un à 5 000 délires dans de l’eau de lavage. Incuber le gel avec une solution DAPI pendant 30 minutes à une heure.
Ensuite, lavez deux fois de plus avec trois millilitres d’eau. Enduisez la chambre d’imagerie à fond de verre à six puits de trois millilitres de polylysine à 0,01% pour immobiliser les échantillons de gel. Ensuite, transférez les échantillons de gel dans la chambre d’imagerie codée et imagez les échantillons avec les portées de fluorescence souhaitées.
La microscopie à expansion de rétention de l’étiquette montre un marquage par fluorescence amélioré par rapport à la microscopie à expansion de rétention de protéines ou aux échantillons de microscopie à expansion de biotine. La microscopie à expansion de rétention de marquage montre un signal de fluorescence environ six fois plus élevé que la microscopie d’expansion de rétention de protéines. LR-ExM peut capturer efficacement de petites structures, telles que des fosses revêtues de clathrine avec une résolution limite de sous-défraction.
Les microtubules et les fosses recouvertes de clathrine étaient des colorations co-immunologiques utilisant des ancrages fonctionnels, NHS MA creus et NHS MA biotine. De même, les fosses et les mitochondries recouvertes de clathrine ont été marquées à l’aide d’une approche de marquage protéique enzymatique avec des ancrages trifonctionnels, tels que la biotine BG MA et BC MA dig. De plus, l’approche basée sur l’immuno-marquage et l’approche de l’étiquette protéique enzymatique sont combinées pour montrer la structure de la lamine A / C et du complexe nucléopore.
La microscopie d’expansion de la rétention du marquage a été réalisée sur le tissu cérébral de la souris en co-immuno-colorant le marqueur présynaptique, Basson, et le marqueur postsynaptique, Homer 1. Les deux étiquettes étaient claires et bien séparées, ce qui favorise la haute résolution et l’efficacité de l’étiquetage. La microscopie à expansion de la rétention de travail est une méthode polyvalente et robuste, qui peut être combinée avec toute autre microscopie à expansion précédemment introduite.
Pour l’imagerie haute résolution, il est important d’obtenir une bonne efficacité d’étiquetage pour mieux capturer la structure à l’échelle moléculaire. La microscopie à expansion de la rétention de travail est une méthode efficace et robuste pour améliorer le signal.
