Ce protocole fournit un modèle cellulaire utile pour étudier la fonction et la perméabilité des barrières vasculaires sélectives telles que la barrière hémato-rétinienne ou hémato-encéphalique avec un accent particulier sur la transcytose endothéliale. Ce test est facile à mettre en place et à utiliser et ne nécessite aucun animal vivant. Il peut être utilisé pour étudier divers régulateurs moléculaires de la perméabilité des cellules endothéliales et de la transcytose affectant l’intégrité de la barrière hémato-rétinienne interne.
Ce test peut fournir des informations sur la biologie vasculaire et la recherche sur les yeux et le cerveau, permettant de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au contrôle de la BHE BRB et d’explorer l’administration potentielle de médicaments à travers les barrières. Pour commencer, préparez les inserts de filtre de culture cellulaire pour l’ensemencement des cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires rétiniennes humaines ou HRMEC, en enduisant chaque insert de 200 microlitres de solution de gélatine à 0,1% pendant 30 minutes sous une hotte à flux laminaire. Assurez-vous que la solution couvre toute la surface inférieure de l’insert du filtre.
Prenez une boîte de Petri avec des HRMECs cultivés incubés à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, et aspirez le milieu de croissance. Rincez doucement les cellules deux fois avec 10 millilitres de 1X PBS sous la hotte à flux laminaire pour vous débarrasser des cellules flottantes ou mortes potentielles. Dissocier les cellules avec 0,5 à 1 millilitre de solution trypsine-EDTA à 0,25% et placer la boîte de Petri dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 5 minutes.
Éteindre l’activité de la trypsine en ajoutant 4,5 à 9 millilitres de milieu de culture et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Faites tourner les cellules à 200 fois g pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 3 millilitres de milieu de culture.
Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre manuel ou d’un compteur de cellules automatisé et semer à une densité de 40 000 cellules par insert filtrant. Le volume de suspension cellulaire pour chaque insert est de 250 microlitres. Aspirer la solution de revêtement des puits contenant des inserts perméables et transférer 250 microlitres de la suspension cellulaire par insert, puis ajouter uniquement du milieu à l’un des inserts, qui sera utilisé comme témoin à blanc pour la mesure de la résistance électrique transendothéliale, ou TEER.
Simultanément, ajoutez également 750 microlitres de milieu par puits dans les chambres basolatérales. Conserver la plaque de 24 puits avec inserts perméables dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 7 à 12 jours jusqu’à ce que les cellules cultivées deviennent complètement confluentes et que la valeur TEER souhaitée d’environ 20 ohms par centimètre carré soit atteinte. Avant les mesures TEER, placer la plaque contenant la cellule à 24 puits dans la hotte à flux laminaire à température ambiante pendant 15 à 20 minutes pour l’équilibre de la température.
Pour mesurer le TEER pour les HRMECs, à l’aide d’un système de résistance électrique épithéliale volt/ohmmètre, connectez l’électrode au compteur et équilibrez l’électrode en la trempant d’abord dans de l’éthanol à 70% pendant 15 à 20 minutes, puis en l’immergeant brièvement dans le milieu de croissance EGM de culture cellulaire. Effectuez la mesure TEER en immergeant soigneusement l’électrode, de sorte que la pointe la plus courte soit dans l’insert et que la pointe la plus longue touche le fond du puits. Mesurez d’abord la résistance à travers la commande à blanc, puis pour chaque insert, mesurez TEER en trois exemplaires.
Lorsque vous atteignez la confluence avec des valeurs TEER d’environ 20 ohms centimètres carrés, priver les cellules de sérum pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone en utilisant 0,5% FBS dans EBM dans les deux chambres avant le traitement avec le ligand. L’EBM réduite en sérum a été utilisée tout au long de l’essai. Incuber les cellules en utilisant le milieu réduit au sérum dans la chambre apicale avec une cyanine-3-marqueur fluorescente au ligand de transferrine pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.
Après avoir lavé la monocouche apiquement et basolatéralement 4 fois avec le milieu réduit au sérum, ajouter un milieu frais aux inserts filtrants contenant les cellules et transférer les inserts dans des puits frais de la plaque de 24 puits contenant un milieu réduit au sérum préchauffé. Incuber les cellules pendant 90 minutes supplémentaires dans l’incubateur, puis recueillir le milieu de la chambre basolatérale. Enregistrer l’intensité de fluorescence de la solution à partir de la chambre basolatérale à l’aide d’un détecteur de fluorescence.
Lorsque vous atteignez la confluence avec des valeurs TEER d’environ 20 ohms centimètres carrés, priver les cellules de sérum pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone en utilisant 0,5% FBS dans EBM dans les deux chambres avant le traitement avec le ligand. L’EBM réduite en sérum a été utilisée tout au long de l’essai. Ensuite, traitez les cellules dans la chambre apicale avec les traitements et les contrôles de véhicule souhaités.
Ajouter 5 milligrammes par millilitre de peroxydase de raifort, ou HRP, aux cellules, et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter un milieu frais réduit en sérum dans la chambre apicale et transférer les inserts dans un puits frais contenant un milieu préchauffé. Incuber la monocouche pendant 90 minutes supplémentaires dans l’incubateur.
Après avoir recueilli le milieu de la chambre basolatérale, ajouter 100 microlitres de substrat de peroxydase fluorogénique HRP au milieu collecté et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Arrêter la réaction avec 100 microlitres de solution d’arrêt et détecter les niveaux de produit de réaction du substrat HRP dans le milieu à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence. Avant de démontrer les tests de transcytose in vitro, la visualisation de la transcytose des cellules endothéliales dans la rétine est présentée comme information de base.
Ici, l’image du microscope optique montre une lumière de vaisseau sanguin remplie de HRP provenant d’une section rétinienne de souris de type sauvage de 3 mois colorée avec du DAB. HRP a été injecté rétro-orbitalement. Les vaisseaux rétiniens remplis de HRP peuvent être vus comme un précipité brun foncé au microscope optique.
La coupe ultra mince du microscope électronique à transmission montre des vaisseaux transcytotiques remplis de HRP avec des CMREA représentant la transcytose EC à travers la barrière hémato-rétinienne interne. Ici, la grande vésicule reflète potentiellement le macropinosome et un globule rouge du côté du luminol. L’image TeM montre de petites vésicules transcytotiques remplies de HRP, probablement des vésicules de cavérole, dans le CMRM.
La coloration immunohistochimique de l’anticorps CAV-1 et de l’isolectine B4 démontre la localisation de CAV-1, un marqueur des vésicules de cavéola dans les vaisseaux sanguins rétiniens, dans la rétine de souris de type sauvage âgée de 3 mois. L’image TeM de CAV-1 marqué immuno-gold dans les cellules endothéliales rétiniennes est montrée ici avec une image agrandie de la vésicule de cavéole positive CAV-1. Pour le test de transcytose EC médiée par la clathrine dans les HRMECs utilisant la transferrine, ici, une image au microscope à fluorescence montre la transferrine Cy3 endocytosée de couleur rouge dans les HRMECs colorées avec DAPI en bleu.
Pour la transcytose EC médiée par les cavéoles à l’aide de HRP, la signalisation Wnt est utilisée ici comme exemple pour démontrer le test. La signalisation Wnt a été trouvée récemment pour réguler la transcytose EC médiée par les cavéoles. Les cellules ont été traitées avec un milieu Wnt-conditioned d’activateur de la voie Wnt3a et du Norrin recombinant, avec ou sans l’inhibiteur de signalisation Wnt XAV939 et leurs témoins réactifs.
Les activateurs Wnt ont réduit le niveau de transcytose basée sur HRP, qui ont été inversés par XAV939. Une mesure TEER correcte est cruciale pour déterminer l’intégrité monocouche. Il est grandement affecté par divers facteurs tels qu’une mauvaise manipulation, les fluctuations de température, le milieu de culture, la durée de la culture, et cetera.
Ce test pourrait être modifié en co-culture ou en systèmes de culture organotypique 3D imitant des conditions in vivo.
