Contrairement à d’autres voies métaboliques comme l’élimination du glucose, la synthèse des acides gras n’est pas systématiquement évaluée, ce qui conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est relativement non invasive et qu’elle reflète probablement mieux le flux de synthèse des acides gras que l’utilisation de glucose marqué aux isotopes, où les changements dans la manipulation du glucose en amont peuvent avoir un impact sur les résultats. Ici, nous nous concentrons sur le tissu adipeux brun, mais cette méthode est potentiellement utile pour étudier n’importe quel tissu dans n’importe quel modèle de souris.
Pour commencer, placez les échantillons sur de la glace carbonique. Prenez un tube de microcentrifugation pré-étiqueté, placez-le sur une balance d’analyse et tarez la balance. Placez ensuite une pince à épiler et un scalpel ou une lame de rasoir en acier sur de la glace carbonique pendant 10 à 20 secondes pour refroidir.
Utilisez la pince à épiler pour retirer l’échantillon de tissu congelé du tube et le placer sur un bateau de poids en plastique, qui peut être positionné sur un bloc plat de glace carbonique ou une autre surface pré-refroidie. À l’aide du scalpel ou de la lame de rasoir en acier, disséquez une petite partie du tissu d’un poids équivalent à 5 à 15 milligrammes et placez-la dans le tube de la microcentrifugeuse. Notez le poids exact et répétez l’opération pour chaque échantillon.
Ajoutez un microlitre par milligramme d’acide hexadécanoïque D31 de 10 millimolaires, suivi de trois billes d’acier inoxydable de cinq millimètres à chaque échantillon. Ajoutez ensuite 250 microlitres de méthanol, 250 microlitres d’eau et 500 microlitres de chloroforme à chaque échantillon avec des billes. Placez les tubes dans un bloc pré-refroidi d’un broyeur et mélangez les échantillons à une fréquence vibratoire de 25 hertz pendant cinq minutes.
Retirez les billes à l’aide d’un aimant et centrifugez les échantillons à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une micropipette, prélever un volume fixe de la phase inférieure de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugation étiquetés en conséquence. Ajoutez 500 microlitres de chloroforme à l’échantillon restant et répétez ces étapes.
Placez les tubes avec la phase inférieure combinée sous azote gazeux ou dans un vide centrifuge réfrigéré résistant au chloroforme à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. Pipeter 98 millilitres de méthanol anhydre dans un flacon en verre. Et ajoutez lentement deux millilitres d’acide sulfurique anhydre dans la hotte pour obtenir 2% d’acide sulfurique dans le méthanol.
Mélangez en faisant tourner la bouteille fermée. Ajoutez 500 microlitres de cette solution d’acide sulfurique à 2 % dans du méthanol à chaque échantillon et tourbillonnez brièvement. Incubez les échantillons sur le bloc chauffant à 50 degrés Celsius pendant deux heures et ajoutez 100 microlitres de solution saturée de chlorure de sodium et 500 microlitres d’hexane à chaque échantillon.
Vaporisez vigoureusement les échantillons à température ambiante pendant une minute et laissez-les reposer pendant une minute. Les deux phases devraient être apparentes après cela. Recueillir la phase supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation.
Répétez ensuite l’ajout d’hexane. Et après la séparation de phase, prélevez les échantillons de la deuxième phase supérieure dans les mêmes tubes étiquetés. Sécher les échantillons à température ambiante sous azote gazeux et remettre les échantillons en suspension dans 20 microlitres d’hexane par milligramme de poids tissulaire d’origine.
Transférez immédiatement les échantillons dans un flacon de chromatographie en phase gazeuse en verre avec un insert en verre. Injecter les échantillons dans un seul spectromètre de masse quadruple à chromatographie en phase gazeuse pour déterminer l’abondance des esters méthyliques d’acides gras ou des isotopologues EMAG. Injecter un microlitre d’échantillon dans une entrée fendue ou non fendue à une température d’entrée de 270 degrés Celsius en utilisant de l’hélium comme gaz porteur.
Dans des tubes de microcentrifugation étiquetés à verrouillage sûr, combinez 10 microlitres de chaque échantillon de plasma ou quatre microlitres standard d’hydroxyde de sodium à 10 molaires et quatre microlitres d’acétone à 5 % dans l’acétonitrile. Effectuez cette opération en trois exemplaires pour chaque échantillon. Après avoir incubé les échantillons pendant la nuit à température ambiante, ajoutez 450 à 550 milligrammes de sulfate de sodium à chaque échantillon, ajoutez 600 microlitres de chloroforme dans chaque tube de la hotte et tourbillonnez vigoureusement pendant 15 secondes.
Centrifuger les échantillons à 300 g pendant deux minutes. Prenez des flacons GCMS en verre étiquetés avec des inserts en verre et transférez les aliquotes triplées, puis 80 microlitres du surnageant de chaque échantillon dans les flacons. Fermez hermétiquement les flacons pour l’analyse du SMGC.
Le pourcentage d’enrichissement en D2O dans le plasma de souris sur plusieurs points temporels est indiqué ici. Il a été constaté que l’eau corporelle est enrichie de l’ordre de 2,5 à 6 %, qu’un niveau de base d’enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle est rapidement atteint en une heure et maintenu pendant toute la durée de l’étude. La distribution isotopologue de masse du palmitate dans le tissu adipeux brun après trois jours d’administration de D2O à température ambiante et thermoneutralité est montrée ici.
Ce résultat montre un enrichissement en deutérium M1 et M2 plus élevé à température ambiante. L’enrichissement molaire du tissu adipeux brun et l’enrichissement molaire plasmatique d’une gamme d’acides gras après trois jours d’administration de D2O à température ambiante et de thermoneutralité sont présentés dans cette figure. L’enrichissement à température plus froide a été trouvé dans une large gamme d’acides gras dans le tissu adipeux brun.
Notamment, l’enrichissement plasmatique en acides gras totaux ne suit pas la même tendance que le tissu adipeux brun, mais au lieu de cela, l’enrichissement en acides gras est augmenté avec la thermoneutralité. Ces images représentent l’abondance totale et le palmitate synthétisé de novo dans le tissu adipeux brun après trois jours d’administration de D2O. Le résultat montre une augmentation de la synthèse totale de palmitate à température ambiante.
Soyez prudent lorsque vous utilisez des acides gras sur le SMGC. Assurez-vous que le palmitate n’est pas surchargé car il peut simplement donner des valeurs d’enrichissement isotopique artificiellement élevées. De plus, lors de l’analyse de l’acétone sur le SMGC, assurez-vous qu’il n’y a pas de pic d’acétone de fond avant d’exécuter les échantillons, alors exécutez des blancs pour éliminer toute acétone dans le système.
Cette méthode examine les acides gras totaux dans plusieurs classes de lipides, mais si vous voulez comprendre comment la synthèse des acides gras a un impact sur des classes de lipides spécifiques, vous pouvez d’abord séparer ces classes de lipides à l’aide de la chromatographie, puis extraire les acides gras de ces fractions. Parce que la lipogenèse est un contributeur clé au développement normal, mais aussi à de nombreuses maladies, ce protocole peut être utile dans de nombreux domaines.
