Ce protocole permet l’isolement de composés de mollusques ayant des propriétés anti-cryptococciques. Cette technique offre une approche impartiale pour identifier et isoler les composés des mollusques ayant des propriétés potentielles, y compris tuer les pathogènes fongiques humains. D’autres composés, tels que les inhibiteurs de la protéase du VIH, sont utilisés pour traiter les patients atteints du VIH.
Cependant, l’expansion à d’autres agents pathogènes, ainsi que l’étude des sources naturelles, représentent de nouvelles voies de découverte. La dernière étape est l’étape la plus difficile car les échantillons peuvent ne pas être filtrés. Par conséquent, les échantillons peuvent devoir être dilués pour le filtrage.
Commencez par collecter des mollusques comme Cipangopaludina chinensis dans une zone naturelle désignée et approuvée. Sélectionner des espèces indigènes et envahissantes pour évaluer un large éventail d’effets antifongiques potentiels. Casser délicatement la coquille du C. chinensis à l’aide d’un pilon et d’un mortier et retirer les morceaux solides avec une pince à épiler.
Généralement, 10 mollusques sont regroupés pour le protocole. Prélever et peser environ 15 à 20 grammes de l’échantillon et utiliser des ciseaux pour couper les organes en petits morceaux d’environ 0,5 à un centimètre. Congeler rapidement les échantillons d’organes disséqués et coupés à l’aide d’azote liquide avant de broyer les échantillons d’organes en une poudre fine à l’aide d’un pilon et d’un mortier.
Une fois cela fait, ajoutez environ 15 grammes de poudre d’échantillon d’organe à 30 millilitres d’eau distillée froide pour obtenir un rapport de un à deux. Versez deux millilitres de l’échantillon dans des tubes de deux millilitres à fort impact et ajoutez environ 500 microgrammes de perles en acier inoxydable de trois millimètres à chaque tube. Homogénéiser pendant trois minutes à 1 200 tr/min à quatre degrés Celsius à l’aide d’un mélangeur à balles ou d’un batteur de perles.
Centrifuger le tube à 12 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et jeter la pastille. Filtrer stériliser le surnageant à l’aide d’une membrane de 0,22 micromètre et stocker les échantillons sur de la glace avant de clarifier l’extrait.
Placez l’échantillon surnageant dans un bain thermique à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes et refroidissez-le immédiatement en transférant l’échantillon dans un seau rempli de glace pendant 20 minutes. Centrifuger les échantillons froids à 15 000 G pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et jeter la pastille.
Filtrer stériliser les échantillons à l’aide d’un filtre à membrane de 0,22 micron, puis les stocker sur de la glace. Une fois cela fait, déterminer la concentration en protéines dans les extraits bruts et clarifiés à l’aide d’un test de quantification. La plage optimale de concentration en protéines est de quatre à huit microgrammes par millilitre.
Incuber les échantillons sur de la glace pendant une heure ou congeler dans de l’azote liquide avant de les conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Dans une plaque de fond plat de 96 puits, incuber 10 microlitres de quatre milligrammes par millilitre d’extrait de protéine de mollusque brut ou clarifié, 10 microlitres de subtilisine A, ayant une concentration dans la plage linéaire mesurée, et 220 microlitres de chlorhydrate de tris 100 millimolaires de pH 8,6 pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 10 microlitres de N-succinyl-alanine, alanine, proline, phénolalanine, p-nitroaniline, substrat de la subtilisine A, à une concentration finale d’un KM pour un volume de réaction final de 250 microlitres.
Une fois cela fait, mesurez l’activité enzymatique en surveillant la densité optique à 405 nanomètres toutes les 15 secondes pendant trois minutes. Assurez-vous que les puits sans extraits produisent une courbe droite pendant la lecture. Pour déterminer l’activité enzymatique résiduelle, calculer le rapport de l’activité enzymatique en présence d’extrait de mollusque à celle en l’absence de l’extrait.
Si une activité inhibitrice est observée, mesurer la concentration inhibitrice 50 ou la CI50 en utilisant une gamme de concentrations des extraits. Introduire une seule colonie de C. neoformans de type sauvage H99 dans cinq millilitres de dextrose peptonique extrait de levure ou milieu YEPD à l’aide d’un embout de pipette de 10 microlitres et incuber pendant 16 à 18 heures à 30 degrés Celsius et 200 RPM. Recueillir 500 microlitres de la culture dans une cuvette et mesurer la croissance en lisant la densité optique à 600 nanomètres.
Diluer la culture avec une base d’azote de levure ou un milieu YNB jusqu’à une densité optique finale de 0,02. Co-culture de cellules de C.neoformans avec différentes concentrations d’extraits bruts et clarifiés en mélangeant 10 microlitres des extraits avec 190 microlitres de culture C.neoformans diluée dans une plaque de 96 puits. Mesurez la croissance en lisant la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques toutes les 15 minutes à une heure pendant 72 heures à 200 tr / min et 37 degrés Celsius.
Les extraits de C. chinensis ont pu inhiber l’activité protéolytique de la subtilisine A, qui est liée à la virulence chez Cryptococcus neoformans avec une valeur CI50 de 5,3 microgrammes par millilitre dans les extraits bruts et de 4,53 microgrammes par millilitre dans les extraits clarifiés. L’évaluation des extraits de C. chinensis par rapport aux processus associés à la production de facteurs de virulence de C. Neoformans, y compris la croissance fongique, a montré qu’il y avait une réduction significative de la croissance fongique à 37 degrés Celsius en présence des extraits bruts et clarifiés de C. chinensis. L’évaluation des extraits par rapport à la capsule, à la production de mélanine et à la formation de biofilms a montré qu’il n’y avait aucun changement dans la production de capsules ou de mélanine en présence d’extraits bruts ou clarifiés de C. chinensis.
Cependant, une réduction significative de 70 à 80 % de la formation de biofilm a été observée à des concentrations élevées d’extraits bruts et clarifiés par rapport au témoin non traité. Le succès du protocole dépend de la procédure d’extraction appropriée, y compris le broyage, l’ajout de la quantité appropriée d’enzyme et la lecture juste après l’ajout du substrat. La technique se concentre sur la tolérance thermique en tant que facteur de virulence cryptococcique important.
Cependant, d’autres facteurs de virulence peuvent être évalués tels que la production de mélanine et de capsules, ainsi que la formation de biofilm. Ces résultats ouvrent de nouvelles voies qui constituent de nouvelles approches sur les stratégies antifongiques utilisant des composés naturels qui offrent plus de stabilité, de spécificité et sont moins sujets à la résistance. L’objectif à long terme est de trouver de nouvelles méthodes contre ces pathogènes fongiques et de minimiser les mécanismes de résistance.
